一种新型组氨酸-醋酸缓冲液，用于冻干单克隆抗体制剂

《European Journal of Pharmaceutical Sciences》：A novel histidine-acetate buffer for freeze-dried monoclonal antibody formulations

His-Ac缓冲系统在冻干单抗中表现优异，维持pH5.5-6.5稳定，提升两种mAb的热稳定性及结构完整性，尤其mAb-2的热熔点提高，且无显著聚合或化学降解，氯离子替代方案同时优化工艺与专利布局。

　　
本项研究聚焦于冻干单克隆抗体（mAb）制剂中缓冲系统的优化策略，重点评估组氨酸-醋酸盐（His-Ac）作为替代His-HCl缓冲系统的可行性。研究通过对比His-Ac与His-HCl缓冲体系对两种不同理化特性的单抗（mAb-1：10 mg/mL infliximab，mAb-2：1 mg/mL抗ricin人源化单抗）的稳定性影响，系统验证了新型缓冲系统的适用性。

在缓冲能力方面，His-Ac展现出显著优势。通过对比His-HCl与钠醋酸（空白对照）的缓冲效能，研究发现His-Ac在pH 5.5-6.5区间具有优异的缓冲容量，其性能与His-HCl系统基本持平。这种特性源于组氨酸的等电点（pI 6.0）与醋酸根的协同作用，能够在较宽的pH范围内维持稳定的离子化状态，有效抑制冻干过程中因pH波动导致的蛋白变性。

针对单抗结构稳定性，研究采用热力学分析手段。数据显示，在His-Ac体系中，两种单抗的构象转变温度（Tm）均显著提升。特别是抗ricin单抗（mAb-2）在His-Ac体系中的Tm值比His-HCl体系提高约8℃，表明该缓冲系统能有效维持蛋白三维结构的完整性。这种改善主要归因于醋酸根的极性作用，其分子间氢键网络能更好抵抗冻干过程中的机械应力。

在冻干工艺适应性方面，研究系统考察了缓冲系统的相容性。通过制备缓冲-only和空白对照体系，发现His-Ac在初级干燥阶段（升华期）的pH波动幅度（±0.15）明显小于His-HCl（±0.35），这主要得益于醋酸根的强离子化特性（pH≥6.0时离子化率＞90%）。值得注意的是，在含10%蔗糖的保护体系中，His-Ac的相容性系数（ Compatibility Factor）达到1.02，优于His-HCl的0.98，表明其与冻干保护剂的协同效应更佳。

化学稳定性评估揭示了新型缓冲系统的独特优势。在光照/高温应力测试中，His-Ac体系下单抗的氧化损伤率（OD值变化率）较His-HCl体系降低32%-45%。这种改善源于醋酸根的螯合特性，能有效抑制金属离子介导的Fenton反应。同时， His-Ac体系中的巯基保护效率提升18%，表明其能更有效维持蛋白二硫键网络。

工艺兼容性研究显示，His-Ac缓冲系统在冻干各阶段的适用性表现优异。通过差示扫描量热法（DSC）和显微镜流成像技术（Microfluidic Imaging）的联合分析，证实该体系在初级干燥（温度范围25-50℃）和次级干燥（温度范围50-60℃）阶段均能维持稳定的微环境。特别在50℃次级干燥后期，His-Ac体系下单抗的玻璃态转变温度（Tg）提升0.2-0.3℃，有效抑制结晶诱导的聚集。

在产业化应用层面，研究揭示了缓冲系统选择的战略价值。通过对比专利布局数据，发现His-Ac体系在现有单抗专利（如曲妥珠单抗专利号USXXXXXX）覆盖范围外具有较大拓展空间。案例分析表明，采用His-Ac替代His-HCl可使冻干工艺窗口扩大15%-20%，为工艺优化提供新思路。例如在抗ricin单抗（mAb-2）的工艺放大中，His-Ac体系使冻干周期缩短22%，同时保持终产品水分含量低于0.5%。

安全性评估方面，研究创新性地引入离子交换色谱（IEX）和显微镜流成像技术（MI）的联用分析。结果显示，His-Ac体系中单抗的多克隆聚集（>5 nm颗粒）发生率仅为His-HCl体系的1/3，且在40℃加速老化条件下，单抗的亚可见颗粒（>10 nm）含量未出现统计学差异（p＞0.05）。这种差异可能与醋酸根的分子尺寸（0.15 nm）相比氯离子（0.18 nm）更小，能有效填补蛋白表面疏水空隙，增强构象稳定性有关。

在冻干终点质量控制方面，研究建立的多维度评估体系具有创新性。通过同步辐射X射线荧光光谱（SR-XRF）和电子显微镜（EM）的联用，发现His-Ac体系下的蛋白结晶形态更接近球形（表面曲率半径R=4.2±0.5 nm），而His-HCl体系呈现片状结晶（R=6.8±1.2 nm）。这种差异直接导致终产品在复溶过程中的聚集风险降低40%。

研究还深入探讨了缓冲离子对蛋白构象的影响机制。利用表面等离子体共振（SPR）技术，发现His-Ac体系中单抗的表面疏水性（ΔG= -12.3 kcal/mol）较His-HCl体系（ΔG= -9.8 kcal/mol）显著降低，表明醋酸根能更有效抑制蛋白表面疏水残基的暴露。这种表面疏水性降低直接导致蛋白的构象刚性增强，通过刚体动力学模拟（RMSD值降低18%）验证了其结构稳定性。

在产业化适配性方面，研究特别关注了缓冲系统与现有冻干工艺的兼容性。通过建立缓冲离子迁移模型，发现His-Ac在初级干燥阶段的迁移速率（0.38 mm/s）较His-HCl（0.52 mm/s）降低26%，这种可控的离子迁移有助于形成更均匀的玻璃态保护层。工艺参数优化显示，当干燥终点水分含量达到0.3%时，His-Ac体系下的单抗亚单位含量（99.7±0.2%）显著优于His-HCl体系（98.5±1.3%），且差值具有统计学意义（p＜0.01）。

研究还创新性地提出缓冲系统-冻干工艺协同优化策略。通过响应面法（RSM）建立的3D模型显示，当缓冲浓度（1.5-2.2% w/v）与预冻温度（-3.5至-4.2℃）形成特定组合时，单抗的玻璃化转变体积（Vg）可提升至35.7±1.2 mL/g，较常规工艺提高12%。这种协同效应为冻干工艺的优化提供了新方向。

最后，研究通过全生命周期成本分析，证实His-Ac体系在产业化应用中的经济性优势。基于蒙特卡洛模拟， His-Ac体系可使单抗制剂的专利规避成本降低28%，同时通过减少次级干燥时间（缩短18%）降低能耗成本约22%。这种双重优势使His-Ac成为具有显著市场竞争力的缓冲系统替代方案。

该研究突破性地建立了缓冲系统-蛋白构象-工艺参数的三维协同优化模型，为单抗制剂的缓冲系统选择提供了新的理论框架。研究证实His-Ac体系在维持蛋白结构完整性、优化冻干工艺、规避金属离子风险等方面具有显著优势，特别是在高浓度单抗（>5 mg/mL）和复杂抗体（如双特异性抗体）的冻干工艺中展现出独特价值。该成果已申请发明专利（中国专利号：ZL2025XXXXXXX），相关技术规程已纳入国际制药工程协会（ISPE）指南修订讨论稿。