《European Journal of Pharmacology》：The immune thrombocytopenia therapeutic Avatrombopag alleviates osteoporosis by targeting NFATc1 signaling
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通过计算筛选发现FDA批准的免疫 thrombocytopenia药物Avatrombopag可抑制NFATc1，抑制破骨细胞生成，并在去势小鼠模型中验证其抗骨质疏松疗效。
胡阳阳|陈志贤|胡思涛|周成宇|陈晓军|魏世尧|王丁|梁凯音|吴鹏|陈雷|陈凯|王璐
中国温州医科大学第一附属医院骨科
摘要
骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病，其特征是破骨细胞活性增加和骨质流失，其临床管理仍存在未满足的需求。通过对抗FDA批准的药物库进行计算机模拟（in silico）药物筛选，我们发现Avatrombopag（Ava）——一种用于治疗免疫性血小板减少症（ITP）的促血小板生成素（TPO）受体激动剂——能够有效抑制核因子活化T细胞c1（NFATc1），而NFATc1是破骨细胞生成的主要转录调节因子。事实上，Ava在体外显著抑制了破骨细胞的生成，且即使在低浓度下也表现出显著的抑制效果。分子对接分析显示，Ava与NFATc1具有高亲和力，能与GLN-419和ASP-417残基形成氢键。这一相互作用通过药物亲和力响应目标稳定性（DARTS）和细胞热位移测定（CETSA）得到了进一步验证。此外，Ava还抑制了破骨细胞标志基因（Nfatc1、Fos、Ctsk、Acp5）的表达，并抑制了破骨细胞的吸收功能。为了评估其在体内的治疗潜力，我们将Ava给予卵巢切除（OVX）诱导的骨质疏松小鼠。微CT和组织学分析（H&E和TRAP染色）显示，Ava能够防止骨质流失，并减少破骨细胞的形成。免疫组化和qPCR检测进一步证实了Ava有效下调了NFATc1的表达。综上所述，我们的研究结果表明，用于治疗ITP的Ava药物可能对破骨细胞相关的骨质流失具有治疗作用，也可能适用于同时患有骨质疏松症的ITP患者。
引言
骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病，其特征是骨量减少和微结构破坏，导致骨折风险增加，尤其是在绝经后妇女和老年人中（Cummings & Melton, 2002）。随着人口老龄化，骨折的发生率急剧上升。例如，在亚洲，预计从2018年到2050年，髋部骨折的数量将增加2.28倍（Cheung et al., 2018）。在绝经后妇女中，雌激素缺乏会加速破骨细胞介导的骨吸收，超过骨形成，最终导致骨质疏松症（Eghbali-Fatourechi et al., 2003）。目前的治疗方法主要针对骨吸收或骨形成。抗吸收药物如双膦酸盐和地诺单抗（Black & Rosen, 2016; Eastell, 1998; Shane et al., 2010）可以抑制破骨细胞活性，但存在颌骨坏死和非典型股骨骨折的风险（Black et al., 1996; McClung, 2016）。促骨药物如特立帕肽可以增强骨形成，但需要每日注射，并且效果会随时间减弱（Neer et al., 2001）。这些局限性凸显了迫切需要更安全、持久的疗法，以在不损害整体健康的情况下恢复骨平衡。
破骨细胞源自造血前体细胞，通过过度骨吸收在骨质疏松症中起关键作用。巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体激活剂配体（RANKL）是破骨细胞生成的关键调节因子。RANKL与其受体RANK的相互作用会触发信号级联反应，激活核因子活化T细胞c1（NFATc1），后者是破骨细胞标志基因（Ctsk、Acp5）的主要转录调节因子（Boyle WJ, 2003; Teitelbaum, 2000）。RANKL通过TRAF6和c-Fos通路诱导NFATc1表达，并激活钙信号通路以促进NFATc1向细胞核的转运。NFATc1表达上调会破坏骨重塑，加速病理性骨质流失（Takayanagi, 2007）。因此，针对NFATc1可能是抑制雌激素缺乏性骨质疏松症中破骨细胞过度活跃并维持生理骨重塑的有效策略。
我们假设临床批准的小分子药物可能对NFATc1具有特异性和亲和力，从而发挥抗破骨细胞作用。在这项研究中，我们使用分子对接程序AutoDock4（Santos-Martins et al., 2021）对FDA批准的药物库进行了高通量计算机模拟筛选，并确定Ava是NFATc1的一个有前景的配体。Ava临床上用于治疗慢性免疫性血小板减少症（ITP）和肝硬化相关血小板减少症，通过刺激血小板生成（Markham, 2021）。值得注意的是，皮质类固醇——一线ITP治疗药物（Bolton-Maggs & George, 2021）——长期使用反而会加重骨质疏松症（Buckley & Humphrey, 2018），这突显了需要具有骨保护作用的替代ITP治疗方法。
为了评估Ava对破骨细胞相关疾病的治疗潜力，我们首先进行了TRAP染色以评估其对破骨细胞生成的影响。使用AutoDock Vina进行的分子对接模拟以及小分子-蛋白质相互作用测定证实了其对NFATc1的高亲和力，并确定了其在蛋白质上的潜在结合位点。进一步的体外实验表明，Ava有效抑制了破骨细胞标志基因和蛋白质的表达以及破骨细胞的吸收功能。在卵巢切除（OVX）小鼠模型中，Ava通过抑制破骨细胞的生成成功减轻了骨质流失。这些发现表明Ava是一种具有双重作用的药物：既能促进血小板生成，又具有意想不到的抗骨质疏松作用，可能为骨质疏松症的管理提供新的治疗策略。
试剂
Avatrombopag（商品编号HY-13463）、Midostaurin（商品编号HY-10230）和γ-Oryzano（商品编号HY-B2194）购自MedChemExpress LLC（中国上海）。这些分子溶解在二甲基亚砜（DMSO，Solarbio，北京，商品编号D8371）中，制备成100 mM的储存浓度。相同稀释度的DMSO用作溶剂对照。胎牛血清（FBS）和α-改良的基本培养基（a-MEM）购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。CCK-8检测试剂盒
计算机模拟药物筛选发现Ava是一种非细胞毒性的NFATc1配体
筛选使用的是带有GPU加速功能的AutoDock4版本（Santos-Martins et al., 2021），该程序评估了FDA批准的小分子药物与NFATc1之间的结合亲和力（图1A）。我们确定了十个具有强计算结合亲和力的NFATc1配体（图S1），并选择了三种分子——Avatrombopag、Midostaurin和γ-Oryzanol——进行进一步实验验证，因为其他潜在候选物可能对骨骼有害。
讨论
随着人口迅速老龄化，骨质疏松症已成为一个全球性的健康问题（Cummings & Melton, 2002）。现有的治疗方法存在显著局限性（LeBoff et al., 2022），这突显了迫切需要更安全、更易获得的疗法，这些疗法能够有效抑制骨吸收同时保护整体健康。我们假设其他适应症的FDA批准药物也可能对骨质疏松症具有治疗效果，因此可以考虑重新利用这些药物。
CRediT作者贡献声明
王璐： 监督、方法学设计、研究实施、资金获取、概念构思。
胡阳阳： 撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、研究实施、数据分析、数据管理。
陈志贤： 撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、研究实施、数据分析、数据管理。
陈雷： 监督、方法学设计。
陈凯： 撰写——审稿与编辑、监督、概念构思。
周成宇： 方法学设计、研究实施、数据管理。
未引用参考文献
Boyle et al., 2003.
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
数据可用性
数据可应要求提供。
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（82372368）和温州市科技局项目（2023Y0117）的支持。我们感谢Schr?dinger, LLC提供PyMOL软件用于分子可视化。同时感谢Yunan Chen（http://dx.doi.org/10.5281/zenodo.6645614）和Nicolás De Francesco（http://dx.doi.org/10.5281/zenodo.4912419）提供
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