《Fish & Shellfish Immunology》：Dynamic immune responses of yellowfin seabream (
Acanthopagrus latus) following recurrent challenge with
Amyloodinium ocellatum
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阿米洛迪虫（Amyloodinium ocellatum）感染鲈鱼（Acanthopagrus latus）后，通过三次亚致死挑战逐渐产生抗性，但系统性抗体反应未增强。克隆表达的AlIgM重链及多克隆抗体分析显示，鳃部IgT基因表达显著上调，提示黏膜免疫机制是抗性来源。
李志成|王晨曦|王宝屯|庄静宇|李安兴
浙江宁波大学海洋科学学院，宁波315832，中华人民共和国
摘要
Amyloodinium ocellatum是一种对全球海水养殖业造成严重破坏的寄生虫。目前尚无有效的疫苗来对抗这种病原体。本研究探讨了Acanthopagrus latus对A. ocellatum反复感染的动态免疫反应。在经历多次亚致死剂量感染后，第三次感染时寄生虫的数量显著减少，表明鱼类已经产生了保护性免疫反应。为了阐明其背后的免疫机制，研究人员克隆了A. latus的IgM重链（AlIgM）并进行了重组表达，以生成特异性多克隆抗体。AlIgM的开放阅读框（ORF）长度为1,341个碱基对，编码447个氨基酸的蛋白质。尽管观察到了抗性的产生，但受感染鱼类的血清未能显著增强抗体对卵孢子的固定作用。此外，通过间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测量的总IgM水平和特异性IgM水平在反复感染的鱼类中要么保持不变，要么甚至下降。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析显示，在第五次感染期间鳃部IgT的表达显著上调，这表明这种免疫球蛋白可能在黏膜免疫中起作用。这些结果表明，A. latus对A. ocellatum的抗性并非由系统性抗体反应介导，而是可能通过局部黏膜免疫机制实现的。
引言
寄生性甲藻Amyloodinium ocellatum是引起“海洋天鹅绒病”（amyloodiniosis）的病原体，是全球温水海水养殖系统中最为严重的外寄生虫感染之一[1]。它主要感染宿主鱼的鳃、皮肤和鳍部，导致严重的组织损伤、渗透调节功能障碍、呼吸窘迫以及高死亡率，尤其是在集约化养殖条件下[2]、[3]、[4]。A. ocellatum的生命周期始于自由游动的卵孢子，这些卵孢子附着在宿主上并发育成滋养体。成熟后，滋养体会脱离并形成包囊（tomont），然后通过无性繁殖产生大量可移动的卵孢子，完成生命周期[5]、[6]。这种寄生虫具有高度传染性，在适宜的环境条件下能迅速繁殖，使得疫情控制变得尤为困难[7]。A. ocellatum具有广泛的宿主特异性，已在超过46个科的111种鱼类中记录到其感染案例[8]、[9]、[10]。随着温水海水养殖业的持续扩张，A. ocellatum已成为一个值得关注的病原体[7]。
在海水养殖生产中，由A. ocellatum引起的疾病爆发通常在寄生虫在系统中完成多个生命周期后才发生。在这种情况下，鱼类可能在初次爆发后存活下来，但仍会反复接触到该寄生虫[10]、[11]、[12]。然而，关于反复亚致死剂量暴露下的宿主-寄生虫相互作用机制仍知之甚少。由于这种外寄生虫感染并寄生于上皮组织，因此位于黏膜层的上皮细胞及其分泌物对于宿主的防御至关重要[13]、[14]。越来越多的证据表明，硬骨鱼类在反复接触同一寄生虫后可以产生增强的免疫反应[15]、[16]、[17]、[18]。例如，从Ichthyophthirius multifiliis的亚致死剂量中恢复的Cyprinus carpio表现出至少持续八个月的抗再感染能力[17]。先前被I. multifiliis感染的Oncorhynchus mykiss的黏液和血清显示出显著的抗寄生虫活性[18]。同样，被Cryptocaryon irritans感染的鱼类在血清和皮肤黏液中产生了针对该寄生虫的特异性IgM抗体，这些抗体在抵御再次感染中起着关键作用[19]、[20]、[21]。研究表明，A. ocellatum感染也能诱导宿主的免疫反应；从amyloodiniosis中恢复的鱼类能够获得对再次感染的保护[22]、[23]。对Amphiprion frenatus的实验性感染表明，反复的亚致死剂量暴露可以诱导其对A. ocellatum的持久免疫[22]。此外，在实验性免疫的Oreochromis aureus的血清中也检测到了针对该寄生虫的抗体[24]。然而，目前仍无有效的A. ocellatum疫苗。在开发出保护性疫苗之前，需要进一步研究鱼类对反复A. ocellatum感染的免疫反应。
黄鳍鲷（Acanthopagrus latus）是一种经济价值较高的海洋鱼类，广泛分布于中国、韩国、日本、马来西亚等国家的沿海地区[25]。选择A. latus作为研究A. ocellatum的模型生物，是因为它对该寄生虫具有高度敏感性，感染后死亡率较高，并且适应实验室养殖条件[6]。在使用A. latus作为宿主的实验性传播试验中，暴露于亚致死剂量A. ocellatum的鱼类在再次感染时表现出更高的耐受性。尽管在多次感染后仍能从同一鱼类中分离出寄生虫，但寄生虫的数量逐渐减少，尤其是在第五次或更多次感染后。基于这些观察结果，本研究的目标如下：（1）生产针对AlIgM的多克隆抗体，从而为后续研究建立可靠的免疫学工具；（2）评估A. latus是否可以通过反复感染A. ocellatum而获得耐受性；（3）研究A. latus对反复A. ocellatum攻击的动态免疫反应。
实验鱼类和培养条件
从中国珠海市的一家当地水产养殖场采购了平均体重为10–15克的健康A. latus鱼（n = 500条）。在28°C的温度下，将这些鱼放置在多个180升的玻璃水族箱中（每个水族箱30–40条鱼）进行两周的适应期，期间随机检查（n = 6）鳃和鳍的活检样本以确认没有A. ocellatum感染。在整个适应期间，鱼被喂食商业化的1毫米颗粒饲料
AlIgM基因的特性与分析
AlIgM的开放阅读框长度为1,341个碱基对，编码447个氨基酸（图1）。该蛋白质的理论分子量为49.7 kDa，理论等电点为5.28。保守结构域分析显示AlIgM包含三个保守结构域，分别对应于重链的恒定区域：CH1（氨基酸1–98）、CH2（97–192）和CH4（325–429）。重组AlIgM蛋白的表达与纯化
溶解度分析表明，目标蛋白主要以包涵体的形式存在（图S1）。
讨论
当前研究中一个备受关注的主题是鱼类对寄生虫感染的免疫反应，因为这对可持续水产养殖实践具有重大意义[29]、[30]。越来越多的证据表明，鱼类通过反复的非致命感染可以发展出有效的获得性免疫，从而显著增强其对后续感染的抵抗力[22]、[23]、[24]。本研究证明了A. latus的反复亚致死剂量暴露...
CRediT作者贡献声明
李志成：研究、方法学、软件开发、初稿撰写。
王晨曦：研究、方法学、初稿撰写。
王宝屯：研究、方法学。
庄静宇：方法学。
李安兴：项目管理、资源协调、监督、验证、审稿和编辑。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了广东省海洋经济发展专项基金（GDNRC [2024]26）的支持。
