Kielin/类似chordin的蛋白（KCP）的缺乏通过抑制自噬来促进巨噬细胞向M1型极化，从而加剧多柔比星引起的心肌损伤

《Forensic Science International: Synergy》：Kielin/chordin-like protein(KCP) deficiency exacerbates doxorubicin-induced myocardial injury by promoting macrophage M1 polarization through autophagy inhibition

本研究探讨KCP在doxorubicin诱导的心肌损伤中的作用，通过基因敲除小鼠模型、巨噬细胞分离及转录组测序，发现KCP通过p38/mTOR通路抑制自噬，加剧M1极化及心肌损伤，为防治提供新靶点。

　　

王一博|季青薇|甘丽人|冯永奇|潘恒|卢熙怡|叶静|邱玲月|李青宽|张建伟|万俊|王远|叶迪

摘要

目的

已有研究表明KCP参与了心脏重塑和心脏衰老过程。本研究旨在探讨KCP是否通过调节免疫和炎症反应，在多柔比星（DOX）诱导的心脏损伤中发挥调控作用。

结果

利用实时定量PCR、Western blot和免疫荧光染色技术检测了多柔比星诱导的心肌损伤小鼠模型左心室中KCP的表达情况。通过超声心动图评估了野生型（WT）小鼠和KCP敲除（KO）小鼠的心脏功能，并通过免疫荧光染色和HE染色进一步确认了组织学结果。从野生型（WT）小鼠和KCP敲除（KO）小鼠中提取骨髓来源的巨噬细胞（BMDM），并在多柔比星处理后进行RNA测序，以识别差异表达的基因及相关信号通路。利用BMDM验证了KCP在巨噬细胞M1极化及炎症反应过程中的调控作用和潜在机制。研究发现，在多柔比星诱导的心肌损伤模型中KCP表达下调；体外实验表明多柔比星处理可降低BMDM中的KCP表达。KCP缺乏显著加剧了多柔比星诱导的心脏功能障碍和心肌损伤，并促进了巨噬细胞的M1极化。RNA测序结果显示，多柔比星处理后KCP缺乏与自噬和p38 MAPK信号通路相关。进一步的体内和体外研究表明，KCP缺乏通过p38 MAPK/m-TOR通路抑制BMDM中的自噬过程。

结论

这些结果表明，KCP缺乏通过p38 MAPK/m-TOR通路介导的对自噬的抑制作用，从而加剧了小鼠多柔比星诱导的心肌损伤。

引言

多柔比星（DOX）作为一种广谱化疗药物，其临床应用受到剂量依赖性心肌损伤风险的限制，这种损伤涉及氧化应激、线粒体功能障碍和炎症反应等多种机制[1]。巨噬细胞不仅仅是“免疫哨兵”；它们还广泛参与发育、修复、血管生成和代谢等多种生理过程。从根本上说，巨噬细胞将各种微环境信号转化为维持体内稳态的多种效应，其极化状态是这一过程的细胞表现[35]。最新研究表明，在多柔比星诱导的心肌损伤过程中，免疫细胞的极化状态（尤其是巨噬细胞向促炎型M1表型的转化）是介导心肌损伤的关键因素[2]。Kielin/chordin样蛋白（KCP）是一种分泌性糖蛋白，通过调节骨形态发生蛋白（BMP）和转化生长因子-β（TGF-β）信号通路参与组织纤维化和修复[2][3]，它能够增强BMP信号通路，同时抑制TGF-β和激活素的信号传导。临床证据表明，心力衰竭患者的心肌中KCP表达显著升高，且与疾病严重程度正相关，这提示其在调节心脏应激反应中的潜在作用[4]。然而，其在化疗诱导的心脏毒性中的作用仍有待阐明。

自噬作为维持细胞稳态的关键过程，在心肌细胞中具有双向调控作用：适度激活可以清除受损的线粒体，而过度抑制则会加剧氧化应激和细胞凋亡[5]。研究发现，多柔比星通过抑制AMPK信号通路干扰心肌细胞中的自噬过程，导致错误折叠蛋白质的积累[6]，而自噬缺乏与巨噬细胞的M1极化（表现为iNOS、IL-1β等的高表达）密切相关[7]。值得注意的是，作为自噬的核心调控通路，p38/mTOR通路在异常激活时可以抑制自噬体形成并促进NF-κB驱动的炎症反应[8]。然而，KCP是否通过影响自噬和巨噬细胞极化参与多柔比星诱导的心肌损伤仍需实验验证。

本研究的目的是探讨KCP是否通过p38/mTOR通路在多柔比星诱导的心肌损伤模型中影响巨噬细胞自噬过程，从而影响巨噬细胞的M1极化和心肌损伤的程度。

部分内容摘要

动物模型

本研究获得了武汉大学人民医院动物研究伦理委员会的批准，并按照美国国立卫生研究院（NIH）的《实验室动物护理和使用指南》进行。

来自南京大学模式动物研究所（JAX:000664，Jackson Laboratory）的C57BL/6J背景的KCP敲除小鼠被用于实验。同一窝中的野生型小鼠作为对照。所有动物均置于恒定室温环境中。

多柔比星诱导的心肌损伤模型中KCP表达降低，巨噬细胞M1极化增强

我们首先在体内检测了KCP的表达情况。实验结果显示，多柔比星处理后第三天，小鼠心脏组织中的KCP蛋白表达水平下降最为显著（图1A）。我们观察到多柔比星处理后心脏组织中的巨噬细胞浸润逐渐增加（图1B），并且第四天巨噬细胞向M1极化的现象最为明显（图1C和D）。同时，我们也观察到KCP表达的下降。

讨论

本研究在体内和体外探讨了KCP在多柔比星诱导的心肌损伤中的作用及其潜在机制。我们发现，在多柔比星诱导的心肌损伤过程中KCP表达下调，伴随巨噬细胞M1极化的增强。为了研究KCP的功能，我们使用了KCP敲除小鼠，结果表明KCP敲除小鼠的心肌损伤更为严重，巨噬细胞的M1极化也更为明显。

局限性

本研究中使用了全身性KCP敲除小鼠，因此观察到的任何表型可能反映了KCP缺乏在多个器官和细胞系中的累积效应。鉴于KCP不仅存在于巨噬细胞中，还存在于肾脏、血管和其他组织中，尽管进行了巨噬细胞转移实验（结果2.7），我们仍无法将模型中观察到的保护或致病效应完全归因于巨噬细胞功能的变化。

作者贡献声明

王一博：撰写——初稿、研究设计、概念构思。季青薇：撰写——审阅与编辑、方法学设计。甘丽人：结果验证、研究实施。冯永奇：数据分析。潘恒：撰写——审阅与编辑。卢熙怡：撰写——审阅与编辑。叶静：撰写——审阅与编辑、资源协调。邱玲月：项目管理。李青宽：项目管理。张建伟：项目管理。万俊：监督、资源协调。王远：监督、项目指导

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号：82370431）的资助。

利益冲突声明

我们声明本手稿的提交不存在利益冲突，所有参与研究的作者均已阅读并批准了该手稿。我代表我的合作者声明，所描述的工作是原创研究，尚未在任何其他地方发表，也未被考虑用于其他出版物。本研究符合手稿中所述的伦理规范。