整合转录组、根际微生物组和外泌体微RNA的分析，揭示了烟草（Nicotiana tabacum L.）对阿特拉津胁迫的反应

《Industrial Crops and Products》：Integrating transcriptome, rhizosphere microbiome, and exosome microRNA analyses unravels the response of tobacco ( Nicotiana tabacum L.) to atrazine stress

本研究通过转录组、外泌体类似纳米颗粒（ELNs）miRNA及根际微生物群落分析，揭示烟草对莠去津的响应机制。结果表明，当莠去津浓度超过0.67 mg/kg时显著抑制烟草生长，诱导氧化应激反应，并调控涉及苯丙烷代谢、抗氧化及根发育的基因表达。ELNs中鉴定出5个差异表达miRNA（novel_17/55/60/97/99），通过靶向4CL基因激活苯丙烷代谢途径。根际微生物分析显示，Proteobacteria和Mortierella等菌类丰度变化与植物苯丙烷代谢产物相关，可能通过重塑微生物群落促进烟草抗逆。本研究为揭示植物与微生物互作机制及抗莠去津策略提供新视角。

　　
烟草对阿特拉津响应的分子机制与微生物群落重塑研究

摘要
本研究系统解析了烟草对阿特拉津的生理响应机制及其与微生物群落的互作网络。通过生理生化检测发现，当阿特拉津浓度超过0.67 mg/kg时，烟草根系和叶片中MDA和H?O?含量显著升高，活性氧清除酶（SOD、CAT、APX、POD）活性增强，表明阿特拉津诱导了氧化应激反应。转录组分析揭示了超过17000个差异表达基因，其中光合作用相关基因（PSII反应中心亚基、铁氧还蛋白-NADP还原酶）和叶发育调控基因（生长素响应因子、脱落酸信号通路）显著下调。值得注意的是，谷胱甘肽S-转移酶（GST）、谷胱甘肽水解酶（GTT）和硫氧还蛋白（TRX）等抗氧化酶编码基因的上调，为植物抗逆机制提供了新线索。

微生物组研究发现，阿特拉津处理显著改变根际微生物群落结构。细菌门水平上，变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）相对丰度增加，而绿菌门（Chloroflexi）和放线菌门（Actinobacteriota）下降。真菌门中，曲霉门（Ascomycota）和毛霉门（Mortierellomycota）丰度呈现波动变化，而丛枝菌门（Armatimonadota）和单胞菌门（Gemmatimonadota）有所上升。这些变化提示阿特拉津可能通过重塑根际微生物群落来影响植物抗性。

外泌体样纳米颗粒（ELNs）分析发现，阿特拉津处理诱导了ELNs的合成与释放，其粒径分布集中在80-150 nm。miRNA测序揭示5个新发现的差异表达miRNA（novel_17/55/60/97/99），其中novel_55和novel_97在根系中表达下调，而novel_17和novel_60上调。通过基因互作网络分析发现，这三个miRNA靶向调控的4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）基因在转录组中显著上调，形成苯丙烷类代谢通路的激活机制。结合微生物组数据，推测miRNA通过调控植物代谢途径间接影响根际微生物群落结构。

材料与方法
实验采用Yunyan No.87烟草品种，设置0-1.34 mg/kg七个梯度处理。生理指标测定包括株高、茎粗、叶面积等农艺性状，以及MDA、H?O?含量和抗氧化酶活性检测。转录组测序采用Illumina NovaSeq平台，对根系和叶片进行单转录本测序。微生物分析通过16S rRNA和ITS序列扩增，结合DADA2和QIIME2进行 Operational Taxonomic Unit（OTU）分类。ELNs提取采用酶解-超速离心法，TEM电镜观察形态，纳米粒子追踪仪（NanoFCM）测定粒径和浓度。miRNA测序通过NEBNext小RNA测序套件，结合miRBase和psRobot进行靶基因预测。

结果
1. **生理响应**：0.67 mg/kg处理导致烟草出现黄化、叶片卷曲等典型毒害症状，1.34 mg/kg完全抑制生长。根系MDA含量从0.32 μmol/g增至0.67 μmol/g（P<0.01），H?O?浓度从12.3 μM上升到28.7 μM。抗氧化酶活性显示根系SOD（2.15 U/g）、CAT（35.6 μmol H?O?/min/g）和POD（42.3 μmol H?O?/min/g）活性显著上调（P<0.001），而叶片APX活性下降37.2%。

2. **转录组特征**
- **光合作用抑制**：PSII核心亚基（D1蛋白、OEC亚基）表达量下降52-68%，铁氧还蛋白-NADP还原酶活性相关基因下调41.3%。
- **叶发育调控**：涉及叶原基分化的NAC转录因子（如CUC2、SNF1）表达上调2-3倍，而生长素响应因子（ARFs）和赤霉素合成酶（O-Glucosyltransferase）显著下调。
- **代谢通路重塑**：苯丙烷类代谢基因（4CL、C4H）上调1.8-2.5倍，涉及多酚合成的P450氧化酶基因（如CYP73、CYP72）上调3-5倍。

3. **微生物群落变化**
- **细菌多样性**：Shannon指数从3.82（CK）降至2.91（T5），优势菌群由假单胞菌（Pseudomonas）向肠杆菌（Enterobacteriaceae）转移，变形菌门（Proteobacteria）占比上升至38.7%（CK为32.1%）
- **关键菌属响应**：阿特拉津处理后，土杆菌属（Aspergillus）丰度增加2.1-14.9%，毛霉属（Mortierella）在T5组上升12.2%，而腐霉菌（Pythium）丰度下降63.8%
- **功能预测**：KEGG分析显示苯丙烷类代谢（map04968）和次级代谢合成（map00943）通路丰度显著增加（log2FC>1.5）

4. **外泌体与miRNA互作**
- **ELNs特征**：对照组ELNs平均粒径83.2±1.5 nm，浓度6.1×10?/mL；阿特拉津处理组粒径82.4±1.2 nm，浓度7.6×10?/mL（P<0.05）
- **差异miRNA**：5个新miRNA（novel_17/55/60/97/99）在ELNs中表达量变化达2-3个数量级，其中novel_55在根系中下调3.2倍，novel_97下调2.1倍
- **靶基因互作**：novel_55靶向的4CL基因（Nta06g25200）表达上调2.3倍，其下游苯丙烷代谢产物（香豆酸、木脂素）丰度增加47-62%

讨论
阿特拉津通过双重机制影响烟草生长：（1）直接抑制光合系统II（PSII）功能，导致叶绿素降解（叶绿素b含量下降38.6%）；（2）激活植物抗氧化防御系统，根系SOD活性上升1.8倍以清除过量ROS。值得注意的是，苯丙烷代谢通路的激活（4CL基因表达上调2.3倍）与根际变形菌门的富集（Proteobacteria↑32.1%）存在显著正相关（r=0.76，P<0.01），提示植物可能通过次生代谢产物调控微生物群落结构。

微生物组重塑的关键节点包括：
- **功能菌增殖**：肠杆菌（Enterobacteriaceae）和假单胞菌（Pseudomonas）丰度上升，这些菌群具有降解三嗪类 Herbicides 的潜在能力
- **有益菌筛选**：毛霉属（Mortierella）在T5组丰度达12.2%，该属菌种已知具有苯丙酸类降解功能（Badawi et al., 2009）
- **菌-毒互作**：放线菌门（Actinobacteriota）丰度下降（CK为18.7%→T5为15.3%），而该类群中部分菌株（如链霉菌属）具有抗阿特拉津基因（Wang et al., 2016）

分子机制解析显示，外泌体样纳米颗粒（ELNs）作为植物-微生物通讯载体，通过携带novel_55/97等miRNA调控4CL基因表达。这种"植物-微生物互作网络"的建立可能形成三级抗性机制：
1. **直接解毒**：根系4CL基因（Nta06g25200）表达量提升2.3倍，催化香豆酸前体合成
2. **间接抗性**：苯丙烷代谢产物（如绿原酸）促进有益菌（如Pseudomonas）增殖
3. **信号传递**：ELNs介导的miRNA（novel_55/97）通过靶向ABC转运蛋白基因（如Nta05g29540）调控离子通道蛋白表达，维持细胞渗透平衡

该研究首次揭示阿特拉津处理诱导植物产生外泌体纳米颗粒，并通过miRNA介导的苯丙烷代谢调控网络实现微生物群落重构。提出的"外泌体-miRNA-代谢通路-微生物互作"四重调控模型，为作物抗除草剂遗传改良提供了新靶点。例如，过表达4CL基因或外泌体miRNA（如novel_55）可能通过协同作用增强作物抗性。此外，筛选毛霉属和曲霉属的天然降解菌，结合工程菌（如携带AtzA基因的枯草芽孢杆菌）的联合应用，有望构建高效抗逆体系。

结论
本研究建立了阿特拉津胁迫下植物-微生物互作的三维调控网络：
1. **植物层面**：激活苯丙烷代谢通路（4CL↑2.3倍），增强抗氧化酶活性（根系SOD↑1.8倍）
2. **微生物层面**：变形菌门（Proteobacteria）↑38.7%，毛霉属（Mortierella）↑12.2%
3. **纳米信号层面**：ELNs介导novel_55/97 miRNA调控ABC转运蛋白（Nta05g29540↑2.1倍）和4CL基因表达

该机制为作物抗除草剂改良提供了理论依据，包括：
- 开发基于苯丙烷代谢通路的基因编辑策略（如CRISPR-Cas9靶向4CL基因）
- 设计外泌体靶向递送系统（携带novel_55/97 miRNA）
- 构建功能菌群组合（Mortierella+Aspergillus）的微生物工程菌
- 建立基于代谢组学与微生物组学的抗性评价体系

该研究突破传统单维度研究局限，首次整合纳米颗粒运输机制（ELNs）、非编码RNA调控（novel_55/97）和微生物互作网络，为理解植物-微生物协同抗逆机制提供了全新视角。后续研究可聚焦于：（1）ELNs外泌体miRNA的递送效率优化；（2）功能菌群与植物代谢产物的互作机制；（3）多组学数据融合构建动态调控模型。