对一种古菌dUTP酶的结构和功能研究揭示了该酶通过亚结构域介导底物识别及进化适应的机制

《International Journal of Cardiology Congenital Heart Disease》：Structural and functional insights into an archaeal dUTPase reveal a subdomain-mediated mechanism for substrate recognition and evolutionary adaptation

古菌Methanosarcina mazei的dUTP酶晶体结构解析显示其通过独特亚结构域I协调底物磷酸基团并稳定三聚体界面，替代典型V结构域机制，分子动力学和定点突变验证了催化功能，为工程化开发耐逆性核苷酸处理酶提供新框架。

　　

陈胜嘉|周春芝|陈文明|邱世一|黄良伟|黄成宏|张三智|郭家宏|许春华

台湾高雄科技大学海洋食品科学系，高雄81157

摘要

尽管古菌dUTP酶在核苷酸代谢中起着关键作用，但人们对它们的了解仍然有限。本文报道了来自Methanosarcina mazei的三元dUTP酶的晶体结构，分别在1.45 ?和1.53 ?分辨率下获得了其游离态（apo）和与dUTP结合态的形式。与利用保守基序V形成活性位点的典型dUTP酶不同，这种酶采用了一个独特的结构插入物（亚基I）来协调dUTP的γ-磷酸基团并稳定三聚体界面。定点突变（N55A和R58A）证实了亚基I的催化相关性。分子动力学模拟显示配体能够稳定原本灵活的C末端区域。比较结构和系统发育分析将这种古菌酶归类为II型dUTP酶，但突出了其独特的底物识别机制。这些发现揭示了在没有基序V的情况下维持酶活性的另一种结构策略，扩展了我们对dUTP酶多样性的理解，并为工程化高效的核苷酸处理酶提供了潜在框架。

引言

脱氧尿苷5′-三磷酸核苷酸水解酶（dUTP酶；EC 3.6.1.23）是维持所有生命领域基因组完整性的关键酶。通过将dUTP水解为dUMP和焦磷酸，它防止尿嘧啶错误地掺入DNA中，同时为dTTP的生物合成提供前体[1]。细胞内高dUTP/dTTP比率可能导致DNA复制过程中尿嘧啶的掺入，从而触发碱基切除修复循环和基因组不稳定[[2], [3], [4]]。

从结构上看，dUTP酶具有多样性，可分为同三聚体、同二聚体和单体形式[[5], [6], [7]]。三聚体形式最为普遍，存在于真核生物、细菌、古菌和病毒中[3,8]。这些酶通常采用保守的果冻卷β-桶状结构，活性位点通过五个保守的基序（IV）在亚基界面形成[9]。来自Homo sapiens [10]、Arabidopsis thaliana [11]、Escherichia coli [12]、Mycobacterium tuberculosis [13]、牛痘病毒[14]和非洲猪瘟病毒[15]等物种的三聚体dUTP酶的晶体结构揭示了关键的结构策略，例如通过C末端臂交换来稳定亚基间的相互作用。

虽然基序I–IV在dUTP酶中具有结构保守性，但基序V变化很大，是将其分为两大类型的基础。I型酶存在于真核生物和病毒中，其延长的C末端基序V插入到相邻原聚体形成的活性位点中，形成高度互锁的三聚体。相比之下，II型酶主要存在于细菌中，其较短的基序V折叠回同一个原聚体上，使得每个活性位点仅由两个亚基构成[8,10]。

尽管已有大量关于细菌和真核生物dUTP酶的结构数据，但古菌同源物的研究仍然不足。值得注意的是，序列分析表明许多古菌dUTP酶缺乏典型的基序V，这引发了关于底物识别和三聚体稳定性如何实现的有趣问题[16]。鉴于古菌在系统发育和环境上的多样性，这些酶可能代表了催化和寡聚化方面的进化差异。

除了生物学作用外，dUTP酶还具有重要的生物技术应用。在基于PCR的系统中，dUTP经常被dTTP替代，以便通过尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）的降解来控制交叉污染[17,18]。在需要精确控制核苷酸代谢的DNA扩增和合成生物学平台上，具有增强稳定性或改良底物特异性的工程变体特别有趣。

在这项研究中，我们展示了来自中温古菌Methanosarcina mazei的dUTP酶（MmdUTPase）的晶体结构，包括其游离态和与dUTP结合态。与典型的dUTP酶不同，MmdUTP酶缺乏典型的基序V，而是利用一个独特的亚基来协调磷酸基团并稳定三聚体。通过结构分析、定点突变和分子动力学模拟，我们揭示了一种替代的底物识别机制，支持了由亚基驱动的催化和古菌dUTP酶进化分化的模型。

章节片段

MmdUTP酶及其突变体的克隆、表达和纯化

编码Methanosarcina mazei dUTP酶（MM1628）的基因在BamHI和HindIII位点被扩增并克隆到pQE-30载体中，从而表达了带有N末端His?标签的融合蛋白。使用突变引物通过重叠延伸PCR生成了定点突变体（N55A和R58A）（表S1）。所有构建物均通过DNA测序进行了验证。

质粒被转化到E. coli BL21(DE3)细胞中进行蛋白质表达。培养物在添加了...

MmdUTP酶的整体结构

Methanosarcina mazei dUTP酶（MmdUTPase）的游离态晶体结构在1.45 ?分辨率下被确定（表1）。不对称单元包含三个通过非晶体学三重对称性排列的亚基，形成了环状三聚体。垂直于3重轴的表面是一个边长为50.2 ?的等边三角形（图1A）。每个亚基由171个氨基酸残基组成，分子量约为19.1 kDa，采用果冻卷β-桶状结构

尽管序列存在差异，但催化结构仍保持保守

dUTP酶对于维持dUTP/dTTP比率和防止尿嘧啶错误掺入DNA至关重要，这一功能在所有生命领域中都是保守的[1,10]。尽管不同生物体的dUTP酶序列同源性较低，通常低于25%，但它们仍保留了保守的催化机制。这是通过五个保守的基序（I至V）实现的，这些基序通过底物定位、金属协调和碱基识别来介导dUTP的水解[9]。

MmdUTP酶在结构上与之相符

结论

本研究首次获得了来自Methanosarcina mazei的古菌dUTP酶的高分辨率结构，包括其游离态和与dUTP结合态。MmdUTP酶采用典型的三聚体结构，但缺乏其他dUTP酶所具有的保守基序V残基。相反，它利用一个独特的亚基I来协调底物磷酸基团并稳定三聚体界面。尽管其结构与双功能dCTP脱氨酶–dUTP酶相似，但MmdUTP酶没有表现出可检测的dCTP脱氨酶活性

CRediT作者贡献声明

陈胜嘉：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、资金获取、数据管理、概念化。周春芝：验证、方法学、正式分析、数据管理。陈文明：资源提供、方法学、数据管理。邱世一：资源提供、数据管理。黄良伟：数据管理。黄成宏：数据管理。张三智：数据管理。郭家宏：撰写——原始草稿、资源提供、概念化。许春华：

资助

本工作得到了台湾国家科学技术委员会（NSTC113-2311-B-992-001和NSTC114-2313-B-992-001）对S.-C.C.的资助；以及NSTC111-2113-M-002-015-MY3、NSTC111-2311-B-002-008-MY3和NSTC114-2113-M-002-009-MY3对C.-H.H.的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢台湾国立大学生命科学学院和计算与系统生物学中心提供的关键支持。部分研究在台湾国家科学技术委员会支持的国家同步辐射研究中心进行。同步辐射蛋白质晶体学设施得到了国家生物技术核心设施计划的支持。