《International Journal of Cardiology Congenital Heart Disease》：The TNF–TNFR–TRAF6 axis mediates NF-κB-dependent antiviral immunity against DIV1 in shrimp
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虾类抗病毒免疫机制中TNF-TNFR-TRAF6信号轴的功能与分子基础。通过解析凡纳滨对虾LvTNFR基因及其与LvTNF的相互作用，揭示了该受体通过结合TRAF6激活NF-κB同源物Dorsal，促进抗菌肽表达及抗DIV1病毒感染的核心作用，并鉴定了PHLPP等下游效应分子。
Xuzheng Liao|Sihong Liu|Shihan Chen|Jinjiao Wang|Jianguo He|Chaozheng Li
中国广东省湛江市中山大学海洋科学学院，生物控制国家重点实验室/南方海洋科学与工程广东实验室
摘要
肿瘤坏死因子（TNF）及其受体（TNFR）在脊椎动物免疫中构成了一个核心信号轴，但它们在无脊椎动物抗病毒防御中的作用仍不明确。在这里，我们在Litopenaeus vannamei中鉴定出一个结构完整的肿瘤坏死因子受体（LvTNFR），并证明了它与其配体LvTNF在抵抗十足类虹彩病毒1（DIV1）的抗病毒防御中的关键作用。系统发育分析将LvTNFR归类为无脊椎动物TNFR分支，该分支缺乏DEATH结构域，但保留了保守的TNFR相关因子（TRAF）结合基序。LvTNF和LvTNFR在DIV1感染后均上调表达，通过RNA干扰沉默任一基因都会导致病毒复制增加和虾的存活率下降。蛋白质相互作用实验确认LvTNFR特异性地与LvTRAF6结合，从而建立了TNF–TNFR–TRAF6信号轴。功能分析显示，这一信号轴激活了NF-κB同源物LvDorsal，促进其核转位，并诱导抗菌肽的表达。转录组分析进一步鉴定了与免疫相关的下游效应因子，包括PH结构域富亮氨酸重复蛋白磷酸酶（PHLPP），其抑制可能通过Akt–IKK途径增强核因子κB（NF-κB）的激活。总体而言，这些发现揭示了虾中保守的TNF–TNFR–TRAF6信号轴，为无脊椎动物抗病毒免疫提供了机制上的见解，并提出了抗病育种的潜在遗传靶点。
引言
Litopenaeus vannamei（俗称太平洋白虾）是全球最重要的经济虾类之一。目前，已有超过30个国家和地区从事这种虾的大规模养殖。然而，虾养殖的迅速扩张伴随着疾病爆发的日益严重问题，这继续限制着全球虾养殖业的可持续发展[1]。许多研究表明，L. vannamei易受多种病原体的影响，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫[2]。其中，虹彩病毒最近成为虾养殖中一种高度致命的病原体。2014年，分别从Cherax quadricarinatus和L. vannamei中独立分离出了两种新的虹彩病毒CQIV和SHIV[3,4]。2019年，国际病毒分类委员会（ICTV）执行委员会将这些病毒归类为十足类虹彩病毒1（DIV1）的毒株[5]。流行病学调查表明，DIV1感染可导致L. vannamei的死亡率接近100％[6]。目前，对DIV1的研究主要集中在其基因组结构[3]、致病机制[7]、检测方法[8]、临床症状[3]以及对宿主组织的组织病理效应[3]的分析上。尽管取得了这些进展，但对虾对DIV1感染的免疫反应了解仍然有限。
肿瘤坏死因子超家族（TNFSF）和TNF受体超家族（TNFRSF）是感染、炎症、自身免疫疾病和组织稳态的关键调节因子[9]。TNF受体（TNFRs）是一类I型跨膜蛋白，其特征是具有细胞外半胱氨酸富集结构域（CRDs），这些结构域通过链内二硫键连接高度保守的半胱氨酸残基形成[10]。迄今为止，已鉴定出29种TNFR家族成员，其中大多数主要在免疫细胞中表达[11,12]。根据所含的细胞质信号域及其相互作用的细胞内适配蛋白，TNFRs被分为两个亚家族。一个亚家族包含含有DEATH结构域（DD）的TNFRs，这些受体与其他含有DD的结构域如Fas相关死亡结构域（FADD）和TNF受体相关死亡结构域（TRADD）相互作用，从而引发凋亡信号传导[13,14]。另一个亚家族由TNF受体相关因子（TRAF）家族成员调控[15]。TNF配体可通过多种TNFR激活广泛的下游信号通路，包括caspase级联反应、核因子-κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）p38和c-Jun N末端激酶（JNK）通路[16],[17],[18]。然而，由于TNF-TNFR网络的功能冗余性和复杂性，特定TNFR的选择性激活机制仍不清楚[19]。
与脊椎动物不同，虾等无脊椎动物缺乏适应性免疫系统，完全依赖先天免疫进行防御。这包括部署模式识别受体（PRRs），以检测和响应入侵微生物呈现的保守病原体相关分子模式（PAMPs）[20]。在PRR库中，TNFRs对于协调先天免疫反应和介导病原体识别至关重要[21]。在这项研究中，我们从L. vannamei基因组中鉴定并表征了一个全长TNFR基因，并建立了虾中的TNF-TNFR信号轴。我们的结果表明，TNF与TNFR之间的相互作用可能通过调节虾免疫系统的成分来影响DIV1感染。
实验动物和DIV1挑战
实验用的L. vannamei虾平均体重为5.1±0.2克，来自中国广东省茂名的Hisenor公司的养虾场。在实验使用前，随机选取了5%的样本进行PCR或RT-PCR检测，以检测常见病原体并确认无病原体状态[22]。这些虾在受控条件下（温度25±0.5°C，盐度25‰）的海水水族箱中适应了一周。
本研究中使用的DIV1是从
LvTNFR的序列分析和系统发育特征
先前的研究已在L. vannamei中鉴定出一个TNFR超家族基因，称为LvTNFRSF[24]。然而，基于L. vannamei的基因组，我们鉴定出了一个更完整的TNFR家族基因，将其命名为LvTNFR。LvTNFR的全长转录本为1982 bp，包括52 bp的5′非翻译区（UTR）、439 bp的3′ UTR和1491 bp的开放阅读框（ORF）（GenBank登录号PX270868）。该ORF编码一个496个氨基酸的蛋白质，预测分子量为
讨论
了解L. vannamei的先天免疫机制对于开发应对威胁全球虾养殖业的新兴病原体的策略至关重要。虽然已在虾中鉴定出多种保守的信号通路，包括Toll、IMD、JAK/STAT和prophenoloxidase级联反应，但TNF-TNFR信号通路的功能仍很大程度上未被探索[2]。在这项研究中，我们系统地鉴定出一个结构完整的TNFR同源物（LvTNFR），并首次证明了
CRediT作者贡献声明
Xuzheng Liao：撰写初稿、研究、资金获取、正式分析、数据管理。Sihong Liu：研究、数据管理。Shihan Chen：研究。Jinjiao Wang：研究。Jianguo He：监督、方法学设计、概念构思。Chaozheng Li：撰写、审稿与编辑、监督、项目管理、方法学设计、资金获取、概念构思。
利益冲突声明
所有作者声明本研究在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。
致谢
本研究得到了广东省乡村振兴战略特色产业振兴项目（2024-SPY-00-006）、国家自然科学基金（32373158和32441085）、广东省科技计划（2024B1212060001）和中国博士后科学基金（2024M763741）的支持。资助者在研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿准备方面没有发挥作用。
