《International Journal of Cardiology Congenital Heart Disease》：Integrin β8: A novel prognostic biomarker for ovarian cancer identified through multi-omics-based prognostic models and experimental validation
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基于单细胞转录组与hdWGCNA分析构建13基因卵巢癌预后模型，验证ITGB8通过PI3K-AKT-NF-κB通路促进侵袭，确立其作为新型预后标志物和治疗靶点的临床价值。
Jinhan Yao|Weina Wang|Junrong Zhang|Jin Shi|Mengru Han|Yuquan Zhang
江苏省南通大学附属医院妇产科，中国南通市西四路20号，226001
摘要
本研究旨在识别卵巢癌（OC）的特异性预后生物标志物，开发预后模型，并验证一个关键候选靶点。我们利用单细胞转录组数据和高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）建立了共表达网络。通过Cox/LASSO回归构建了一个13基因的预后特征谱，有效将患者分为高风险和低风险组，这两组的预后有明显差异（外部验证1年AUC = 0.83）。包括CIBERSORT、pRRophetic、GSVA/GSEA和TIDE评估在内的综合分析显示，高风险患者的预后较差，CD8+ T细胞浸润减少，对多种靶向药物的敏感性降低，Hedgehog、NF-κB和PI3K-Akt通路激活减弱，预测的免疫治疗反应也较低。包含风险评分的诺模图显示出良好的预后预测效用。该风险评分是一个独立的预后因素（多变量HR = 1.98）。从特征谱中选出了ITGB8进行实验验证。ITGB8在OC组织和细胞系中表现出显著的过表达。其敲低抑制了OC细胞的增殖、侵袭和迁移（体外），以及体内的肿瘤发生能力。此外，我们发现ITGB8通过激活PI3K-AKT-NF-κB信号通路促进侵袭，这一点通过敲低后的磷酸化减少和PI3K激动剂恢复侵袭得到了证实。本研究成功建立了一个经过验证的OC预后模型，并将ITGB8确定为一个新的预后生物标志物和功能性癌基因，为其未来作为治疗靶点的研究提供了支持。
引言
卵巢癌（OC）是一种高度异质性的疾病，其中上皮性卵巢癌（EOC）是最常见且致命的类型，占病例的95%以上[1,2]。EOC的恶性行为主要由肿瘤上皮细胞驱动，这些细胞构成了肿瘤的主体，并在肿瘤发生、进展和治疗抵抗中起关键作用。然而，上皮细胞内的分子异质性及其预后意义尚未得到充分研究。大约70%的患者在诊断时已处于晚期（III/IV期），五年生存率低于30%[3]。临床管理面临重大挑战，包括早期检测困难、高化疗耐药率和缺乏个性化的预后评估系统[4]。
目前，OC的预后评估和精准治疗的发展受到两个主要瓶颈的阻碍：首先，现有的临床预后模型（如FIGO分期、CA125水平）通常缺乏分子层面的分辨率，无法捕捉驱动恶性行为的根本分子异质性，从而限制了它们的预测准确性和临床应用[[5], [6], [7], [8]]。其次，尽管已经提出了几种基于转录组的多基因预后特征谱，但大多数都是从整体组织分析中得出的[9]。这种方法的局限性在于，它将不同细胞类型的基因表达平均化，从而稀释了细胞类型特异性信号。这限制了肿瘤上皮内关键分子驱动因素的检测和验证——而这些因素正是恶性的核心。因此，需要新的预后工具来直接探测上皮肿瘤的核心。
在这种背景下，整合素β亚基8（ITGB8）及其相关信号通路引起了我们的兴趣。整合素作为关键的跨膜受体，介导肿瘤与微环境的相互作用。在多种实体瘤（如肺癌、胶质瘤）中，ITGB8的表达升高，并与较差的预后相关[[10], [11], [12], [13], [14]]。先前的生物信息学研究已将ITGB8确定为高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的潜在预后生物标志物，其高表达与较差的生存率相关[15]。然而，对其致癌作用的功能验证和更深入的机制理解仍然不足。因此，我们的研究旨在利用多组学方法定义ITGB8在上皮细胞中的特异性作用，将单细胞分辨率与功能检测相结合。
为了直接克服整体组织分析的局限性并确定OC进展的上皮细胞特异性驱动因素，我们的研究实施了多分辨率转录组数据的顺序分析。我们首先利用单细胞转录组学来解析肿瘤微环境，然后应用高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）专门针对上皮细胞亚群[16]。这种以上皮细胞为中心的方法使我们能够基于肿瘤的核心生物学机制构建多基因预后模型。随后，我们重点关注关键候选靶点ITGB8，实施了一个从生物信息学预测到实验验证的全面验证策略，包括免疫组化、细胞功能检测和动物模型。
本研究通过关注OC的上皮细胞核心，建立了一个多组学预后工具。它不仅验证了ITGB8作为一个新的预后生物标志物，还验证了它作为一个功能性癌基因的作用，为其未来作为潜在治疗靶点的研究奠定了基础。
材料与试剂
SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、IOSE80和HEK293T细胞系购自上海梅湾生物技术有限公司。HEYA9和OVCAR8细胞系购自 Zhili Zhongte（武汉）生物技术有限公司。Rabbit抗β-actin抗体（Sigma-Aldrich，#A5441）和HRP标记的Goat抗Rabbit抗体（Sigma-Aldrich，#AP32）购自美国Sigma-Aldrich公司。Anti-ITGB8抗体（Abcam，#ab317021）和anti-Ki-67抗体（Abcam，#ab16667）购自美国Abcam公司。
单细胞图谱、亚型注释及上皮细胞聚焦
使用GSE184880数据（7个肿瘤/5个正常样本），55,061个细胞通过了质量控制（nFeature_RNA < 6000且percent.mt < 40且nCount_RNA < 50,000）（图S6A–B；图S6C中的前10个变异基因）。PCA显示了批次效应（图S6D），通过Harmony软件进行了校正（图S6E）。ElbowPlot确定最佳主成分数量为30（图S6F）。UMAP识别出19个簇（图1A）。SingleR注释了8种细胞类型：上皮细胞、单核细胞、T细胞等（图1B），其中疾病样本中的上皮细胞比例显著更高（P = 0.012）（图1
讨论
本研究通过以肿瘤上皮细胞为中心的多组学方法，建立了一个13基因的卵巢癌预后特征谱。通过将单细胞转录组学与hdWGCNA相结合，我们试图超越广泛的组织学分类，探究肿瘤形成细胞的分子程序。这一策略导致了一个与疾病进展相关的共表达网络的识别，以及ITGB8作为关键因素的确定
结论
总之，这项多组学研究为卵巢癌患者的分类提供了一个预后工具，并提供了功能性和机制性证据，支持ITGB8在肿瘤上皮细胞中具有重要的自主致癌作用。这些发现为针对ITGB8的开发靶向抑制剂以及探索其在肿瘤-免疫相互作用中的功能作用奠定了基础，从而提升了其作为卵巢癌治疗靶点的潜力。
CRediT作者贡献声明
Jinhan Yao：正式分析、概念构思、方法学设计、资源获取、验证、可视化、撰写——审稿与编辑、资金筹集。Weina Wang：软件使用、数据管理、监督、初稿撰写。Junrong Zhang：项目管理、撰写——审稿与编辑。Jin Shi：数据管理、软件使用、监督。Mengru Han：研究实施、资源获取、撰写——审稿与编辑。Yuquan Zhang：资金筹集、项目管理、撰写——审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Jinhan Yao报告称获得了江苏省研究生研究与实践创新计划的财政支持。Yuquan Zhang报告称获得了江苏省研究医院项目的财政支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系
致谢
本研究得到了江苏省研究医院项目（YJXYY202204-YSB05）和江苏省研究生研究与实践创新计划（KYCX24_3599）的支持。
