四嗪增强的供体-受体-供体金属有机框架用于光动力抗菌治疗及伤口愈合

《Nature Communications》：Tetrazine-enhanced donor-acceptor-donor metal-organic frameworks for photodynamic antibacterial therapy and wound healing

本研究针对糖尿病慢性伤口中多重耐药菌感染和愈合受损的临床难题，设计了一种基于四嗪（tetrazine）强电子受体的新型D-A-D结构金属有机框架（MOF）。研究人员通过构建Zn-TDP和Ni-TDP两种MOF材料，显著缩小了材料带隙，实现了高效可见光驱动的活性氧（ROS）生成。进一步负载L-精氨酸（L-Arg）后形成的复合材料（如A@Zn-TDP）可在光照下协同释放ROS、一氧化氮（NO）和活性氮物种（RNS），在低浓度（25μg/mL）下实现对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等病原体的快速广谱杀灭，并有效促进组织再生。动物实验表明，该治疗可使细菌载量降低>95%，并加速伤口愈合。该研究为开发高效抗菌材料提供了新思路。

　　

在全球公共卫生领域，细菌感染，特别是由多重耐药菌引发的感染，正构成日益严峻的挑战。据统计，仅2019年，细菌感染就导致了约1370万例死亡，其中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）是主要的致病元凶，而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA）更是造成了超过10万例死亡。除了系统性感染，局部伤口的细菌定植，尤其是在糖尿病等慢性伤口中，会形成致密的生物膜（biofilm）。这种由胞外聚合物（EPS）构成的基质，如同坚固的堡垒，保护病原体免受宿主免疫系统的攻击，并阻碍抗菌药物的渗透，导致感染反复发作和持续性炎症，严重延缓愈合进程。

面对这一难题，迫切需要超越传统抗生素的创新策略。光动力疗法（Photodynamic Therapy， PDT）作为一种非抗生素疗法，利用光激活的光敏剂（Photosensitizers， PSs）产生活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS），通过诱导过氧化损伤和破坏细菌膜来杀灭病原体，展现出巨大潜力。然而，临床批准使用的光敏剂，主要是酞菁（phthalocyanines）、卟啉（porphyrin）和BODIPY等衍生物，普遍存在水溶性差、聚集导致荧光淬灭（aggregation-induced quenching）以及ROS产生效率不理想等问题，限制了其治疗效果。近年来，金属有机框架（Metal-Organic Frameworks， MOFs）因其可调的金属节点和有机连接体，能够实现光敏剂的内在整合，而成为有前景的PDT平台。其稳定的晶体结构有利于高效的光捕获和能量转移，固有的多孔性使其可作为纳米载体共负载其他治疗剂。但广泛研究的光敏MOFs，如PCN-224和NH₂-MIL-125(Ti)，其ROS生成能力仍然不足，对抗顽固感染的效果有限。克服这些限制，需要合理设计MOF结构以提升光敏效率和稳定性。

本研究的核心策略在于优化ROS的生成路径。光敏剂在光激活后，从基态跃迁到激发单重态，再通过系间窜越（Intersystem Crossing， ISC）到达长寿命的三重态，这是高效产生ROS的关键过程。设计供体-受体-供体（Donor-Acceptor-Donor， D-A-D）结构能有效减小ISC能隙，促进电荷分离，延长三重态寿命，从而增强光催化ROS的产生。此外，增强供体的给电子能力或受体的缺电子性，可以显著提高ISC效率，同时减少非辐射能量损失，进而提升ROS量子产率。尽管D-A-D共价有机框架（COFs）的研究已验证了这些设计原则，但D-A-D MOFs仍较为稀缺，主要源于配体共轭控制的挑战和合适受体基团的有限性。

为此，研究人员提出将四嗪（tetrazine）——一种易得、生物相容性好的强电子受体——整合到D-A-D MOFs中，以突破现有PDT的局限。他们报道了两种D-A-D光敏MOFs（Zn-TDP和Ni-TDP）的开发，其合成使用了吡唑-四嗪-吡唑（TDP）配体。这首次展示了四嗪作为强电子接受单元在D-A-D MOF结构中的应用，旨在提升ISC效率和光催化ROS生成能力。Zn²⁺或Ni²⁺与吡唑氮原子的配位形成了稳定的三维多孔框架。

利用其结构稳定性和多孔性，研究人员进一步通过负载L-精氨酸（L-Arg）构建了治疗性复合材料A@Zn-TDP和A@Ni-TDP。这些系统利用光动力产生的ROS触发L-Arg释放一氧化氮（NO）。释放的NO可渗透生物膜，并与ROS反应形成活性氮物种（Reactive Nitrogen Species， RNS），如过氧亚硝酸盐（ONOO^-），从而发挥强大的杀菌作用，同时协调双相免疫反应——在感染初期增强促炎清除能力，随后促进向抗炎阶段过渡。A@Zn-TDP在体外和体内实验中，即使在低浓度（25μg/mL）下，也能有效根除MRSA感染，其疗效优于大多数现有的ROS/NO基系统。这标志着D-A-D MOFs在生物医学领域的应用，其光动力抗菌效力超越了经典的光敏MOFs。这种四嗪驱动的D-A-D设计为开发先进光敏剂拓展了新前沿，并为按需光动力抗菌治疗建立了一个多功能平台，为根除难治性感染和加速糖尿病并发症中的慢性伤口愈合提供了有前景的解决方案。

为开展此项研究，研究人员运用了多项关键技术方法。主要包括：通过溶剂热法合成Zn-TDP和Ni-TDP MOFs；利用粉末X射线衍射（PXRD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、透射电子显微镜（TEM）、X射线光电子能谱（XPS）、氮气吸附-脱附等温线（BET）等手段对材料进行结构表征；通过紫外-可见漫反射光谱（DRS）、莫特-肖特基（Mott-Schottky）曲线和Tauc图分析材料的光化学性质和能带结构；采用电子顺磁共振（EPR）光谱、化学探针（如DCFH-DA、ABDA、NBT）法等检测活性氧（ROS、NO、RNS）的生成；通过菌落计数、Live/Dead染色、扫描电子显微镜（SEM）、结晶紫染色、流式细胞术等评估体外抗菌和抗生物膜活性；利用MTT法、活死细胞染色、溶血实验评价生物相容性；通过划痕实验考察细胞迁移；并最终在高脂高糖饮食联合链脲佐菌素（STZ）诱导的雄性糖尿病小鼠模型上，建立MRSA感染的慢性伤口模型，进行体内治疗效果、组织病理学、炎症因子及血管生成等的综合评价。

结果

材料合成与表征

Zn-TDP和Ni-TDP通过H₂TDP与相应金属醋酸盐的溶剂热反应合成。PXRD分析证实了两种框架的结晶度，其衍射图谱与模拟结构一致。在Zn-TDP中，每个锌原子与四个来自H₂TDP配体的氮原子形成四面体配位，构成稳定的一维链，并通过吡唑基团相互连接。Ni-TDP的PXRD图谱与其模拟结构及Ni-BDP匹配，表明形成了具有fcu拓扑的稳定框架，每个Ni²⁺离子与三个TDP吡唑氮原子和三个来自μ₄-OH/μ₄-OH₂部分的氧原子配位。形态上，TEM显示Zn-TDP形成宽度低于50纳米的棒状纳米结构，而Ni-TDP则为尺寸约20纳米的准球形纳米颗粒。元素映射和XPS分析证实了Zn、Ni、C、N元素在各自框架中的均匀分布及其价态。

光化学性质与能带结构

UV-Vis DRS显示，Zn-TDP和Ni-TDP在550 nm附近有明显的吸收带，与游离H₂TDP配体相似。Ni-TDP在630 nm附近还有一个宽的吸收峰，对应于Ni²⁺的配体场跃迁。通过Mott-Schottky分析和Tauc图计算能带结构，发现Zn-TDP和Ni-TDP的带隙分别为2.11 eV和1.64 eV，显著小于其苯环类似物Zn-BDP（3.73 eV）和Ni-BDP（3.45 eV）。这表明将四嗪作为强电子受体引入D-A-D框架，有效增强了电荷分离。

活性氧（ROS）的生成

使用DCFH-DA荧光探针评估可见光照射下ROS的生成能力。结果显示，Zn-TDP和Ni-TDP在光照5分钟后荧光强度显著增加，表明ROS产量高，且Zn-TDP的增幅最大。EPR光谱分析确认了单线态氧（¹O₂）和超氧阴离子自由基（·O₂^-）的存在。进一步使用ABDA和NBT探针区分发现，Zn-TDP主要通过能量转移机制生成¹O₂，而Ni-TDP则倾向于通过电子转移途径产生·O₂^-。由于¹O₂具有更强的氧化能力和较短的扩散距离，这可能是Zn-TDP表现出更强氧化能力的原因之一。

治疗分子负载与活性物质释放

利用MOFs的微孔结构，成功将L-Arg负载到Zn-TDP和Ni-TDP中，形成A@Zn-TDP和A@Ni-TDP复合材料。表征证实负载后MOF结构保持完整。L-Arg的负载量分别为24.75±1.13 wt%（Zn-TDP）和18.97±1.31 wt%（Ni-TDP）。在光照下，MOF产生的ROS可氧化L-Arg的胍基，触发可控的NO释放。Griess实验表明，A@Zn-TDP在光照60分钟后可释放15.36±0.41 μM的NO。同时，ROS和NO的联合作用促进了高活性RNS——过氧亚硝酸盐（ONOO^-）的生成。此外，材料在光照下还表现出有效的谷胱甘肽（GSH）清除能力，表明其能破坏细菌内的氧化还原平衡。

体外抗菌活性

评估了材料对浮游细菌（包括S. aureus, E. coli, MRSA）的抗菌活性。菌落计数实验显示，在低浓度（25μg/mL）和短时间光照（15分钟）下，Zn-TDP对MRSA的杀菌率高达98.85±0.58%，显著优于其类似物Zn-BDP（71.84±2.36%）以及PCN-224、NH₂-MIL-125(Ti)和NU-1000等经典光敏MOFs。负载L-Arg后，A@Zn-TDP实现了近乎完全的杀菌（>99.99%）。Ni基MOFs（Ni-TDP和A@Ni-TDP）在较高浓度下也表现出良好的抗菌效果，但A@Zn-TDP在低剂量和短时间内的效率更优。Live/Dead染色和SEM观察证实了材料处理后细菌膜结构严重受损。

体外抗生物膜能力

材料对顽固的生物膜感染也表现出显著效果。结晶紫染色和菌落计数表明，A@Zn-TDP在光照下能大幅减少MRSA、E. coli和S. aureus的生物膜生物量和存活菌数。3D荧光成像和流式细胞术显示，经A@Zn-TDP+L处理的生物膜结构被破坏，细菌死亡率显著增加。SEM图像进一步揭示了生物膜细胞的皱缩、凹陷和表面损伤。这种高效的抗生物膜能力得益于ROS、NO和RNS的级联释放：ROS首先破坏生物膜表层结构，NO和随后形成的RNS则深入内部，实现彻底清除。

抗菌机制探究

机制研究表明，材料主要通过以下途径发挥抗菌作用：1) 诱导膜脂质过氧化（MDA水平升高）和增加膜通透性（ANS和ONPG实验证实），导致细胞内容物泄漏；2) 在细菌细胞内产生高水平的ROS、NO和RNS， overwhelming 其抗氧化防御系统（SOD、CAT、NOX酶活性在光照后发生紊乱）；3) 引起细菌DNA氧化损伤（TUNEL实验阳性）。这种多模式攻击策略有效规避了传统耐药途径。

生物相容性

MTT实验、活死细胞染色和溶血实验均表明，A@Zn-TDP和A@Ni-TDP在治疗浓度下对HUVECs（人脐静脉内皮细胞）、HaCaT（人永生化角质形成细胞）和红细胞均无明显毒性，显示出良好的生物相容性和血液相容性。

细胞迁移

划痕实验显示，A@Zn-TDP+L和A@Ni-TDP+L处理能显著促进HUVECs的迁移，加速伤口闭合，这归因于NO释放激活了促愈合信号通路。

糖尿病慢性伤口的治疗评价

在雄性糖尿病小鼠MRSA感染慢性伤口模型中，A@Zn-TDP+L治疗组表现出最快的伤口闭合速度。至第14天，伤口接近完全愈合（99.30±0.19%），显著优于对照组（82.25±3.79%），与万古霉素组效果相当但无残留开放性伤口。组织学分析（H&E和Masson染色）显示，治疗组炎症细胞浸润减少，胶原沉积更有序，表明组织再生加速。第2天伤口组织菌落计数显示，A@Zn-TDP+L组的细菌清除率高达98.39±0.75%。体重、血糖、主要器官组织学和血清肝肾功能指标均未发现明显异常，证实了材料的体内安全性。

炎症和组织重塑动态的调控机制

免疫荧光和ELISA分析揭示了A@Zn-TDP+L治疗对伤口微环境的免疫调节作用。在早期（第1天），其诱导iNOS和促炎因子TNF-α上调，增强抗菌免疫；随后（第3、7天），则促进Arg-1和抗炎因子IL-10的表达，推动巨噬细胞从M1型向M2型极化，加速炎症消退和组织修复。此外，治疗还显著促进了伤口部位CD31和α-SMA标记的血管生成。这种时序性的免疫调控，结合直接的杀菌作用，共同 orchestrate 了高效的愈合过程。

结论与意义

本研究成功开发了基于四嗪增强的D-A-D光敏MOFs（Zn-TDP和Ni-TDP）。通过引入强电子缺体四嗪核心，显著提高了材料的可见光吸收和ROS生成能力，其光动力抗菌性能优于PCN-224等传统系统。进一步负载L-Arg后形成的复合材料，实现了光动力杀菌与NO气体治疗及免疫调节的协同，在低剂量下即可高效清除耐药菌和生物膜，并促进糖尿病慢性伤口的愈合。该工作不仅为对抗耐药菌感染提供了新型高效的治疗平台，也展示了合理设计MOF材料在生物医学领域的巨大潜力，为未来临床转化奠定了坚实基础。