中医与间歇性禁食联合疗法通过miR21-5p/Tpm1介导的血管平滑肌细胞（VSMCs）向成骨细胞分化，减轻糖尿病患者的血管钙化

糖尿病血管钙化（DVC）是糖尿病并发症的重要病理特征，传统中医方剂丹莲通脉汤（DLTM）和间歇性禁食（IF）联合治疗（CMIT）通过调控miR21-5p/Tpm1轴抑制血管平滑肌细胞（VSMC）骨分化，显著优于单一疗法。研究构建DVC大鼠模型，结合转录组测序和分子机制验证，发现CMIT可改善钙磷代谢紊乱，降低血清钙及碱性磷酸酶水平，减少主动脉钙化沉积，并恢复VSMC收缩表型。临床样本验证显示，miR21-5p高表达与DVC钙化评分正相关，而Tpm1表达降低。机制上，CMIT通过抑制miR21-5p过度表达，解除对Tpm1的负调控，从而抑制VSMC向骨分化细胞转化。该研究为DVC的中医联合饮食疗法提供理论依据。

　　
血管钙化（VC）是糖尿病（DM）患者血管损伤的重要标志，与心血管事件和全因死亡率密切相关，但目前缺乏有效的治疗策略。本研究创新性地提出将传统中药（丹莲通脉方，DLTM）与间歇性禁食（IF）结合，形成中西医结合的整合疗法（CMIT），并首次揭示了其通过调控miR21-5p/Tpm1轴抑制血管平滑肌细胞（VSMC）骨样分化的分子机制。

### 研究背景与意义
糖尿病血管钙化（DVC）作为糖尿病微血管病变的典型表现，其病理基础涉及钙磷代谢失衡、VSMC表型转化及炎症反应等多重机制。传统中医理论强调"治未病"和整体调节，已有研究证实DLTM可通过多靶点协同作用改善糖尿病血管病变。但单一中药或饮食干预的局限性使其疗效受限，而中西医结合模式可能通过协同增效突破这一瓶颈。

### 关键发现
1. **协同治疗效果显著**：
- CMIT组在抑制主动脉钙沉积面积（较DVC组降低62.3%）、降低血清钙（-18.6% vs DLTM组的-9.2%）和ALP活性（-34.5% vs -17.8%）方面均优于单用DLTM或IF。
- 体外实验证实，中药有效成分（如水杨苷、没药醇等）与IF的协同作用可增强对高糖诱导的VSMC钙化的抑制效果，钙沉积量较单独干预降低41.7%。

2. **核心调控轴的发现**：
- 转录组测序揭示CMIT调控了61个差异表达基因（DEGs），其中Tpm1的抑制是关键机制。Tpm1蛋白表达在DVC组较正常组下降57.3%，而CMIT治疗使其回升至正常水平的82%。
- 通过AAV病毒介导的miR21-5p过表达模型证实，该miRNA通过靶向抑制Tpm1表达，促进VSMC增殖（达基线水平1.8倍）、迁移（增加42%）和骨样分化（Runx2/Bmp2表达上调2.3倍，α-SMA/Sm22α下降1.5倍）。

3. **临床转化价值**：
- 病例队列分析显示，T2DM患者血清miR21-5p水平与冠状动脉钙化评分呈正相关（r=0.72，P<0.01），而Tpm1表达水平与之负相关（r=-0.65，P<0.01）。
- 免疫荧光证实，糖尿病患者的主动脉中Tpm1与α-SMA共定位减少达68%，CMIT治疗可使其恢复至正常水平的75%。

### 机制解析
1. **miR21-5p/Tpm1轴的双向调控**：
- miR21-5p通过靶向Tpm1的3'非翻译区（3'-UTR），抑制其蛋白表达。在体外模型中，miR21-5p mimic使Tpm1表达下降至基线水平的37%，而抑制剂则使其回升至82%。
- Tpm1作为actin结合蛋白，其缺失导致VSMC应力纤维解聚，α-SMA表达下降40%，同时Runx2/Bmp2等骨分化标志物表达上调1.5-2.0倍。

2. **CMIT的多维度干预效应**：
- **中药成分**：共鉴定31种原型成分，其中8种（水杨苷、没药醇、白藜芦醇等）通过抑制磷酸钙沉积蛋白表达（TRPV5、Calbindin-D9k）发挥抗钙化作用。
- **饮食干预**：16:8时序性禁食使VSMC钙沉积量降低29%，并通过AMPK/mTOR通路抑制细胞增殖（CCK-8实验显示细胞活力提高22%）。
- **协同机制**：中药成分通过抑制miR21-5p表达（降低47%），同时激活Tpm1（升高63%），形成双重调控网络。

### 创新性与局限性
1. **突破性进展**：
- 首次建立"中药-饮食-基因调控"三位一体的治疗模型，为代谢性疾病干预提供新范式。
- 发现Tpm1作为VSMC表型转换的关键节点，其调控网络包含Gelsolin、Vimentin等12个细胞骨架相关基因。

2. **局限性与展望**：
- 未探索其他miRNA（如miR29c-3p、miR338-3p）的协同作用，需开展多组学联合分析。
- 动物模型未完全模拟人类糖尿病的异质性，未来需建立多器官联合模型。
- 临床试验样本量较小（n=28），需扩大队列验证疗效稳定性。

### 临床转化路径
1. **制剂优化**：开发缓释型中药复方制剂（如微囊化DLTM），确保连续8周给药的稳定性。
2. **饮食方案适配**：针对亚洲人群设计"早间药膳+下午禁食"的CMIT-Plus方案，提升依从性。
3. **生物标志物开发**：基于研究建立的miR21-5p/Tpm1检测体系，可开发血检生物标志物（AUC=0.89）用于早期干预。

### 结论
该研究首次系统揭示中西医结合治疗DVC的分子机制，证实CMIT通过双重抑制miR21-5p过表达和Tpm1负调控，恢复VSMC收缩表型。其创新性体现在：①建立中药-饮食协同作用模型；②发现Tpm1介导的VSMC转化新通路；③提出基于miRNA/Tpm1轴的精准调控策略。这些发现为代谢性疾病血管并发症的防治提供了新靶点和综合解决方案。