肺腺癌中琥珀酰化作用的异质性：从预后模型到KLK6驱动的肿瘤微环境重塑

《Frontiers in Immunology》：Succinylation heterogeneity in lung adenocarcinoma: from prognostic model to KLK6-driven tumor microenvironment remodeling

本研究系统解析了肺腺癌（LUAD）中蛋白质琥珀酰化的多组学特征，构建了基于琥珀酰化状态的预后模型并验证其在7个独立队列中的泛癌种适用性。通过单细胞转录组和空间转录组学发现，高琥珀酰化亚型与免疫抑制微环境相关，并通过调控纤维母细胞分化、ECM重构及CD8+T细胞耗竭驱动肿瘤进展。关键靶点KLK6的鉴定及其通过激活MK信号通路促进琥珀酰化的机制，为克服免疫治疗耐药提供了新思路。

　　
肺腺癌（LUAD）作为非小细胞肺癌的主要亚型，其高发病率和死亡率与复杂的分子机制密切相关。近年来，表观遗传修饰如琥珀酰化逐渐成为研究热点，该修饰通过调节蛋白质功能影响代谢和免疫微环境。本研究通过多组学整合和实验验证，系统解析了琥珀酰化在LUAD中的调控网络及其临床意义。

### 一、背景与核心问题
LUAD占所有肺癌病例的50%以上，尽管免疫检查点抑制剂（ICIs）的应用显著改善了部分患者的预后，但整体生存率仍不理想。研究表明，肿瘤微环境（TME）与免疫逃逸存在紧密关联，而琥珀酰化作为一种新兴的蛋白质修饰，可能通过调节代谢重编程和免疫细胞互作影响疾病进展。然而，琥珀酰化在LUAD中的具体作用机制尚未明确，缺乏有效的生物标志物和靶向治疗策略。

### 二、研究方法与数据整合
研究采用TCGA和GEO数据库的公开数据，结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学技术，构建多维度分析框架：
1. **多组学数据整合**：从TCGA和GEO下载超过1600例LUAD患者的转录组数据，结合基因组变异、免疫评分和药物敏感性数据。
2. **核心基因筛选**：
- 通过差异表达分析（FDR<0.05，|log2FC|>1）和单变量Cox回归（p<0.05）从615个琥珀酰化相关基因中筛选出31个核心基因。
- 使用LASSO回归和SHAP值分析优化模型，最终确定7个关键基因（MYLIP、LDHA、TRIM28等）构建预后模型。
3. **单细胞与空间转录组学**：
- 对10例LUAD和10例正常肺组织进行scRNA-seq，鉴定出9类主要细胞群（包括肿瘤细胞、成纤维细胞、免疫细胞）。
- 空间转录组学分析（Visium平台）揭示琥珀酰化在肿瘤组织中的空间异质性，发现高琥珀酰化区域与成纤维细胞、免疫抑制性巨噬细胞高度富集。
4. **体外功能验证**：
- 使用siRNA和过表达载体系统调控A549细胞中KLK6表达。
- 通过CCK-8、伤口愈合实验和Transwell实验验证KLK6对增殖、迁移和侵袭的促进作用。

### 三、关键发现
#### 1. 琥珀酰化景观与分子分型
- **核心基因网络**：31个基因形成包含代谢调控（LDHA、MYLIP）、免疫抑制（TRIM28）、细胞周期（ZFP3）的功能模块。
- **分子亚型划分**：基于主成分分析（PCA）和共识聚类，LUAD分为三型：
- **A型（低琥珀酰化）**：免疫细胞浸润丰富（如NK细胞、CD8+ T细胞），TIDE评分显示免疫检查点抑制较弱。
- **B型（中等琥珀酰化）**：代谢活性介于A型和C型之间。
- **C型（高琥珀酰化）**：成纤维细胞活化显著（α-SMA+比例增加37%），免疫细胞耗竭特征明显（CD8+ T细胞浸润减少52%）。

#### 2. 预后模型与免疫治疗预测
- **预后模型验证**：7基因模型在TCGA和7个独立GEO队列（共包含1200例患者）中均显示良好预测性能（AUC=0.71-0.80）。
- **免疫治疗响应**：低风险组（风险评分< median）接受PD-1抑制剂后客观缓解率（ORR）达68%，而高风险组仅为29%（p<0.001）。
- **临床转化价值**：模型成功整合年龄、病理分期等临床参数，形成临床决策支持工具，AUC值（0.76）优于传统分期系统（AUC=0.68）。

#### 3. KLK6的调控作用与治疗靶点
- **表达特征**：
- KLK6在LUAD组织中的mRNA水平较正常肺组织高2.3倍（p<2.2e-16）。
- IHC染色显示，高级别LUAD中KLK6阳性细胞占比达78%，而正常组织仅12%。
- **功能验证**：
- **体外实验**：过表达KLK6使A549细胞增殖速率提高41%，迁移能力增强2.7倍（p<0.001）。
- **体内机制**：共培养实验表明，KLK6阳性肿瘤细胞通过分泌TGF-β和PDGF促进MRC-5细胞向肌成纤维细胞分化（α-SMA表达量增加3倍）。
- **免疫抑制**：KLK6高表达区域CD8+ T细胞浸润密度降低35%，且与PD-L1高表达显著相关（r=0.42，p=0.003）。
- **网络重构**：
- KLK6+肿瘤细胞与CAFs的胶原蛋白信号通路（COL1A1-ITGA1）和纤连蛋白信号通路（FN1-PDGFRA）存在强互作（F=5.2，p=0.002）。
- 空间转录组学显示，KLK6表达热点区域与SELENOP+巨噬细胞、Tregs富集（p<0.001）。

### 四、机制解析与临床意义
#### 1. 琥珀酰化的多维度调控
- **代谢层面**：高琥珀酰化导致TCA循环中间产物 succinyl-CoA 滞留，激活AMPS/2-OG信号轴（通过ldha和mylip）。
- **免疫层面**：琥珀酰化修饰PD-L1（通过KAT2A去琥珀酰化酶抑制）和HLA-E（通过HDAC2激活），形成免疫抑制微环境。
- **细胞外基质（ECM）重塑**：klk6过表达使ECM沉积量增加2.1倍（FN1 mRNA升高3.5倍），导致基质硬度增加（Young模量从1.2kPa升至2.8kPa）。

#### 2. KLK6的潜在作用机制
- **信号转导假说**：
- KLK6可能通过激活EGFR/MAPK通路（c-Myc表达量升高2倍）促进琥珀酰转移酶KAT2A的磷酸化（p<0.01）。
- 抑制SIRT5活性（NAD+依赖性去琥珀酰化酶），使H3K9 succinylation水平升高1.8倍。
- **细胞间通讯假说**：
- 通过分泌基质金属蛋白酶-9（MMP-9）激活CAFs的TGF-β通路（ACTA2表达量升高4倍）。
- 抑制 CXCL10（-1.2倍）和 CCL22（-0.8倍）表达，减少CD8+ T细胞趋化。

### 五、创新点与局限性
#### 1. 理论创新
- 首次建立琥珀酰化评分与免疫治疗响应的定量关系（风险评分每增加1单位，PDI下降0.15，p=0.007）。
- 揭示KLK6通过"成纤维细胞-基质-免疫细胞"三重调控环路驱动肿瘤进展：
1. 肿瘤细胞→KLK6分泌→激活CAFs（α-SMA+ 3.2倍）
2. CAFs分泌ECM→基质硬度增加→激活TGF-β/Smad通路
3. 抑制CD8+ T细胞浸润（CD8A表达降低58%）

#### 2. 方法学突破
- 开发"空间琥珀酰化指数"（SAPI）：结合Visium数据与IHC染色，实现区域特异性琥珀酰化评分（Cohen's k=0.67）。
- 构建单细胞互作网络（SCINet）：通过CellChat分析发现KLK6+细胞与M2型巨噬细胞共定位度提升2.3倍（p<0.001）。

#### 3. 研究局限
- 生物学功能验证仅限于体外细胞模型（A549/MRC-5），需开展PDX模型或小鼠实验。
- 空间转录组学样本量较小（n=10），需扩大样本量验证。
- KLK6与琥珀酰化酶（如KAT2A）的物理互作尚未明确，需通过Co-IP实验验证。

### 六、临床转化前景
1. **诊断标志物**：
- KLK6联合琥珀酰化评分（SAPI）可区分早期（I-II期）和晚期（IV期）患者（AUC=0.89，p<0.001）。
- 在ctDNA检测中，KLK6甲基化水平与血液循环肿瘤细胞（ctCANCER）富集度呈正相关（r=0.73）。
2. **治疗靶点**：
- KLK6抑制剂（如LY307171）在体外使IC50值降低至0.8nM（p<0.01）。
- 联合PD-1抑制剂可逆转对数倍增的IC50值（从0.8nM升至4.2nM）。
3. **预后分层**：
- 风险评分结合TMB（>60为高肿瘤突变负担）可优化分层（HR=2.1，95%CI 1.8-2.4）。

### 七、总结
本研究首次系统揭示琥珀酰化在LUAD中的多维度调控网络，建立首个基于琥珀酰化的预后模型（AUC=0.79），并鉴定KLK6作为关键治疗靶点。通过整合单细胞测序、空间转录组学及功能验证，发现KLK6通过重塑TME（促进CAFs活化、抑制CD8+ T细胞浸润）和激活琥珀酰化代谢通路驱动肿瘤进展。未来研究需聚焦于：
1. 开发基于KLK6的免疫治疗联合方案
2. 建立琥珀酰化特异性检测平台（如质谱流式）
3. 探索靶向KLK6的免疫检查点抑制剂协同效应

该研究为LUAD的精准分层治疗提供了新思路，特别在克服免疫治疗耐药方面具有潜在临床价值。