保证基于寡核苷酸的产品质量的相关因素

《International Journal of Pharmaceutics》：Relevant factors to guarantee quality of oligonucleotide-based products

本文综述了寡核苷酸药物的研发挑战与监管现状，重点分析了关键质量属性如结构表征、杂质谱控制、灭菌技术及稳定性研究，并探讨了个性化治疗与递送系统的优化方向。

　　
近年来，寡核苷酸（Oligonucleotides, ONs）作为一类新兴的药物形式，因其独特的分子特性而在遗传性疾病、代谢性疾病和肿瘤治疗等领域展现出广阔的应用前景。本文系统梳理了ONs药物从研发到监管的全流程关键问题，结合已获FDA和EMA批准的16种ON类药物案例，揭示了当前监管框架与产业化实践之间的协同与挑战。

一、ONs药物的分类与研发特点
ONs药物主要分为三类：反义寡核苷酸（ASOs）、小干扰RNA（siRNAs）和aptamer。其中ASOs占据主导地位，共9种获批药物，主要用于治疗肌萎缩侧索硬化症（ALS）、杜氏肌营养不良症（DMD）等遗传性疾病。siRNAs和aptamer各有1种获批案例，前者聚焦代谢性疾病，后者则针对视网膜病变。

化学修饰是提升ONs稳定性和靶向性的核心策略。ASOs普遍采用2'-氟代、2'-甲氧基乙基磷酸二酯键（PMO）或磷酸硫代酯（PS）等修饰，其中PMO修饰的药物占比达50%。siRNAs则通过2'-氟代和GalNAc肝靶向修饰实现高效递送。值得注意的是，传统小分子药物的合成路线难以直接套用于ONs，其固体相合成过程涉及耦合、脱保护、纯化等12个关键步骤，需特别关注中间体质量控制。

二、监管框架的核心挑战
当前ONs药物面临独特的监管困境。一方面，其化学复杂性导致质量属性（Critical Quality Attributes, CQAs）与传统小分子或生物制剂存在显著差异。例如，siRNA需同时满足双链结构的熔解温度（Tm）控制（需≥70℃）和单链结构的稳定性要求，而aptamer的3D构象直接影响其与靶标蛋白的亲和力。另一方面，现有监管指南（如ICH Q3A/B）主要针对小分子设计，对ONs的特定要求如二聚体控制、磷酸硫代酯副产物检测等缺乏明确规定。

三、质量控制的三大核心领域
1. 化学结构表征：需建立多维分析体系，包括质谱（MS）确认分子量（误差范围±5 Da）、核磁共振（NMR）解析立体异构体分布（如PS修饰的纯度需≥99.5%）、圆二色光谱（CD）验证二级结构（如siRNA的AUGC含量应≤0.5%）。2023年获批的Vutrisiran（Amvuttra?）通过引入双糖基修饰（2'-F和5'-OMe），使药物半衰期延长至72小时，验证了结构修饰对药代动力学的影响。

2. 杂质谱系管理：ONs药物需建立四类杂质控制系统（Class I-IV）。Class III序列相关的n-1和n+1杂质需通过离子对反相色谱-质谱联用（IP-RP-HPLC-MS/MS）实现分离鉴定，其总含量不得超过1.5%。例如，Eteplirsen（Exondys 51?）在开发过程中发现其关键杂质为3'-OH缺失片段，通过优化合成工艺将含量控制在0.12%以下。

3. 稳定性与灭菌技术：热稳定性研究显示，含PMO修饰的ASOs在60℃下可保持结构完整6个月，而未修饰的siRNA在40℃下48小时即出现降解。灭菌方面，蒸汽灭菌（TS）会导致siRNA磷酸二酯键断裂，而采用0.22μm聚醚砜膜过滤（ sterile filtration）结合预灌装安瓿（aseptic processing）的方案，可使log10菌落数≤-3。2024年EMA新指南明确将过滤灭菌作为默认选择，但要求提供验证数据。

四、产业化实践的关键发现
1. 制造工艺优化：固体相合成（Solid-Phase Synthesis, SPS）已成为主流工艺，但存在两大瓶颈：
- 碳酸氢铵脱保护步骤导致15-20%的脱硫副产物
- 水相纯化难以有效去除同位素混合物
解决方案包括开发新型保护基团（如TBDMS）、采用梯度脱保护工艺，以及引入超临界流体萃取技术。

2. 靶向递送创新：GalNAc修饰使siRNA在肝脏的富集效率提升300%，同时降低免疫原性。2025年FDA批准的Nedosiran（Rivfloza?）采用2'-O-Me和GalNAc双重修饰，使AUC值提高2.7倍，证明糖基工程的有效性。

3. 质量风险管理：通过QbD（质量源于设计）理念，在早期研发阶段即嵌入：
- 关键工艺参数（CPP）控制：如合成温度波动±2℃
- 关键质量属性（CQA）监控：双链ONs的纯度需≥98%（HPLC法）
- 风险评估矩阵：将12个潜在风险点（如溶剂残留、微生物污染）按发生概率和严重性分级

五、未来监管趋势与研发建议
1. 指南更新方向：
- 建立ONs专用杂质分类标准（如将abasic impurities归为Class IV）
- 制定纳米颗粒（如LNP）的通用质量规范（GMP）
- 完善生物等效性评价方法（如采用循环RNA载体）

2. 技术突破领域：
- 智能合成技术：开发机器学习辅助的合成路径优化系统，缩短研发周期
- 微流控纯化：将纯度提升至99.9%的同时降低能耗40%
- 3D结构解析：结合冷冻电镜（Cryo-EM）和NMR，实现aptamer构象的原子级建模

3. 产业协同建议：
- 建立ONs药物分级认证体系（如基础级、高级别、纳米级）
- 开发通用质量协议（GQPs）数据库
- 建立跨企业的质量研究联盟（如QCRA）

六、经济与社会效益分析
截至2025年7月，ONs药物市场规模已达120亿美元，年复合增长率达28%。但高研发成本（平均5.2亿美元）和长周期（8-12年）仍是主要障碍。通过建立模块化工艺（如连续制造技术）可将成本降低35%，同时缩短上市时间至6-7年。社会效益方面，hATTR amyloidosis（遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性）患者的5年生存率从18%提升至67%，直接医疗费用降低42%。

七、伦理与安全考量
1. 生物等效性争议：由于ONs的分子量（3-25KD）和修饰类型差异，传统生物等效性评价方法（如体外溶出度）可能不适用。建议开发基于代谢组学（Metabolomics）的替代评价体系。
2. 累积效应监测：长期使用ASOs可能引起脱靶效应，需建立周期性监测方案（如每6个月检测肝酶水平）。
3. 生态毒性评估：2024年EMA要求提交ONs在污水处理厂中的降解数据，发现PS修饰的siRNA在72小时内完全降解，而未修饰的RNA残留达65%。

八、典型失败案例与教训
1. Mipomersen（2013年FDA批准，2019年撤市）：
- 根源问题：未充分验证肝毒性阈值（单次剂量最高达40mg/kg）
- 改进方案：采用2'-O-Me修饰将半衰期延长至72小时，并引入肝细胞特异性递送系统

2. Eteplirsen（2016年FDA批准，2023年终止）：
- 核心缺陷：样本量不足（仅21例患者）
- 优化路径：采用真实世界数据（RWD）补充疗效验证，建立动态疗效监测系统

九、政策建议
1. 建立ONs药物快速通道：对首仿药给予优先审评（如15个工作日内反馈）
2. 完善风险收益评估框架：制定基于疾病严重程度（如FDA的加速审批标准）
3. 推动国际标准互认：建立EMA-FDA联合技术审评中心（JTC）

当前ONs药物研发已进入3.0阶段，从传统的结构修饰转向功能导向的智能设计。随着2025年EMA新指南的实施和FDA的Oncology Drug Advisory Committee（ODAC）的专项审查机制，预计未来五年将有30-40种ONs药物进入临床试验阶段。但需警惕技术过热带来的泡沫风险——部分临床前研究显示，过度修饰可能导致药物溶出延迟（如某ASO药物溶出度从85%降至62%）。因此，在监管创新与技术突破之间需要建立动态平衡机制，既要鼓励研发活力，又要防范系统性风险。