利用RUBY报告基因监测生菜转基因表达稳定性：揭示LsUBI启动子/终止子组合的多代稳定表达优势

《Plant Cell Reports》：Monitoring the stability of transgene expression in lettuce using the RUBY reporter

本研究针对生菜转基因表达中普遍存在的基因沉默问题，通过RUBY可视化报告系统，系统评估了35S、AtUBI10和LsUBI三种启动子/终止子组合在两种园艺类型生菜中的表达稳定性。研究发现LsUBI启动子/终止子组合能够实现从组织培养再生到T3代均保持强效、均匀的表达，且不易发生沉默；AtUBI10启动子组合可实现中等表达水平；而35S启动子则表现出较高的沉默频率。该研究为生菜转基因育种提供了可靠的表达元件选择方案，对植物基因工程具有重要指导意义。

　　

在植物生物技术领域，实现转基因的稳定表达一直是个核心挑战。生菜（Lactuca sativa）作为全球重要的蔬菜作物，自首次转基因生菜报道至今已近四十年，但其转基因表达体系仍不完善。尤为突出的是，花椰菜花叶病毒35S启动子（35S）虽然在多种植物中能驱动强效表达，但在生菜中却频繁出现基因沉默（silencing）和不稳定性现象。这种基因沉默很可能是植物抵御病毒入侵的进化机制——转录后基因沉默（PTGS）被转基因激活所致。长期沉默会导致转基因及其启动子序列发生甲基化，从而永久关闭表达。以往研究表明，使用不同的启动子/终止子组合会影响沉默概率，但不同构建体在生菜中的系统性比较数据仍然缺乏。

为了解决这一问题，加州大学戴维斯分校的Richard W. Michelmore团队在《Plant Cell Reports》上发表了最新研究成果。研究人员利用新型可视化报告基因RUBY，首次在生菜中对三种不同的表达构建体进行了为期三代的多维度评估。RUBY报告基因的独特优势在于其产物甜菜红素（betalain）呈红色，无需复杂设备或破坏性取样，即可直观监测转基因表达情况，使得从组织培养再生到多代植株发育全过程的表达动态可视化成为可能。

研究团队选用了代表不同园艺类型的两个生菜栽培品种‘Salinas’和‘Cobham Green’，并构建了三种RUBY表达载体：35S::RUBY-tHSP（JD849）、pAtUBI-RUBY-tRBCS和pLsUBI-RUBY-tLsUBI。其中，LsUBI启动子/终止子来源于生菜本身的多聚泛素基因（LOC111919935），AtUBI10启动子来源于拟南芥，而35S启动子则是广泛使用但在此前生菜研究中常报道不稳定的元件。载体通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化方法导入生菜外植体，经过共培养、诱导、伸长和生根等组织培养阶段，最终获得再生植株，并追踪其T₁、T₂和T₃代的RUBY表达情况。

关键技术方法包括：利用Golden Gate模块化克隆技术构建表达载体；农杆菌介导的遗传转化技术将目的基因导入生菜品种‘Salinas’和‘Cobham Green’；通过非侵入性的RUBY报告基因可视化监测技术，动态追踪转基因在组织培养再生、T₁代植株生长发育及T₂、T₃代的表达情况；PCR技术用于转基因植株的分子鉴定。

表达稳定性分析

RUBY在组织培养再生早期的表达

研究发现在愈伤组织和再生芽阶段，三种构建体均能观察到RUBY的表达，但表达强度和稳定性存在显著差异。LsUBI::RUBY构建体在两种生菜背景中均表现出最高的表达率（>95%的愈伤组织显示红色），且红色表型均匀。35S::RUBY构建体的表达率最低（Cobham Green为58%，Salinas为54%），且易出现表达不均一的“混合”（Mixed）表型。统计检验表明，RUBY构建体与表达表型之间存在显著关联（p < 0.0005）。

再生T₁代植株移栽土壤后的RUBY表达

随着再生植株生根并移栽至土壤，LsUBI::RUBY构建体继续保持稳定、均匀的红色表达，在Cobham Green和Salinas中分别有52%和61.5%的植株表现红色表型。AtUBI::RUBY构建体部分植株表现为较浅的粉红色（Rosy），而35S::RUBY构建体则极少有植株表现均匀红色。值得注意的是，所有表现强红色表型的LsUBI::RUBY Salinas植株在移栽后未能存活至成熟，而部分强红色表型的LsUBI::RUBY Cobham Green植株虽然生长良好，但表现出育性降低，这提示高强度的RUBY表达可能对生菜生长和繁殖存在一定负担。

T₁代转基因植株后代（T₂代）的RUBY表达分析

对T₁代植株自交产生的T₂代种子进行表型分析发现，LsUBI::RUBY构建体的红色表型在后代中稳定遗传，分离比例符合单基因插入的孟德尔遗传规律（3:1 Red:Green）。AtUBI::RUBY构建体的后代出现了红色（Red）、粉红色（Rosy）和绿色（Green）的1:2:1分离，提示Rosy表型可能与转基因的半合子（hemizygous）状态相关，即表达水平受基因剂量效应影响。而35S::RUBY构建体的红色表型后代则多为混合表型，表明沉默现象持续存在。

T₃代RUBY表达评估

在T₃代中，LsUBI::RUBY和AtUBI::RUBY构建体来自红色或粉红色T₂代亲本的后代，其表型大多保持了上一代的特征，显示出良好的表达稳定性。特别是LsUBI::RUBY，其T₃代植株中仅出现极少数的混合表型，表明沉默概率极低。相比之下，35S::RUBY构建体的后代中沉默现象则更为普遍。

研究结论与讨论

本研究通过RUBY报告基因系统，清晰地展示了不同启动子/终止子组合在生菜转基因表达稳定性方面的显著差异。主要结论如下：

1. 1.
   LsUBI启动子/终止子组合优势明显：该组合从愈伤组织阶段到T₃代均能驱动强效、均匀的转基因表达，且不易引发基因沉默，是生菜转基因研究中最可靠的表达元件选择。
2. 2.
   AtUBI10启动子组合提供中等表达选项：该组合表达水平略低于LsUBI，但稳定性较好，其特有的“Rosy”表型为需要中等表达水平的应用提供了可能。
3. 3.
   35S启动子组合沉默频率高：该组合在生菜中表现出较高的不稳定性，容易在早期即发生沉默，与既往研究一致。
4. 4.
   RUBY报告基因的应用价值与局限性：RUBY作为一种非侵入性、可视化的报告系统，极大地便利了转基因表达的动态监测。然而，高强度表达RUBY可能对某些生菜品种的生长和育性产生负面影响，提示在实际应用中需权衡表达强度与植物正常生长发育的关系。近期研究指出RUBY编码序列中特定组氨酸密码子可能导致异常转录本切割并引发沉默，未来使用经过优化的RUBY序列可能进一步提升其评估效果。

该研究不仅为生菜转基因育种提供了经过实践验证的高效、稳定表达工具，其研究策略和发现也对其他作物的转基因表达元件评估具有重要的借鉴意义。通过精准选择表达元件，可以最大程度地避免基因沉默，确保目标性状的稳定遗传和表达，从而推动作物遗传改良和生物技术产业的发展。