双层明胶-甲基丙烯酰支架在抑制牙髓炎症和促进类牙本质组织再生中的应用

《Journal of Controlled Release》：Bilayer gelatin-methacryloyl scaffold for pulp inflammation suppression and dentin-like tissue regeneration

牙髓炎症调控与牙本质再生协同的双层电纺GelMA纳米纤维支架研究。该材料通过光交联制备成双层纤维结构，上层负载Ibuprofen（10%-20% w/w）抑制炎症因子NF-κB、IL-1α、TNF-α，下层含无定形磷酸镁（5%-15% w/w）促进ALP、OCN表达及矿化沉积。体外实验显示IBP缓释达14天，AMP层持续释放Mg2?/PO?3?离子达7天。体内实验表明该支架在LPS刺激的人工牙髓腔模型中3小时内快速抑制炎症，14天后显著上调ALPL、DSPP等牙本质再生相关基因，并在皮下植入实验中证实其生物相容性。该双功能材料为活髓治疗提供了同时抑制炎症和促进再生的创新解决方案。

　　

卡罗琳·安塞尔米（Caroline Anselmi）|雷南·达尔-法布罗（Renan Dal-Fabbro）|希沙姆·阿巴达（Hisham Abada）|伊戈尔·保罗尼诺·门德斯·索亚雷斯（Igor Paulino Mendes Soares）|莱斯·M·卡多佐（Lais M. Cardoso）|阿卜杜勒·H·马哈茂德（Abdel H. Mahmoud）|朱莉娅·C·卡塔拉诺（Julia C. Catalano）|安娜·贝亚特丽兹·戈麦斯·德·卡瓦略（Ana Beatriz Gomes de Carvalho）|韩圆圆（Yuanyuan Han）|普拉巴哈·西克德（Prabaha Sikder）|安娜·施文德曼（Anna Schwendeman）|乔西梅里·赫布林（Josimeri Hebling）|马可·C·博蒂诺（Marco C. Bottino）

美国密歇根大学牙科学院龋病学、修复科学与牙髓病学系，安娜堡，密歇根州

摘要

在活髓治疗（VPT）中，平衡牙髓组织炎症与牙本质再生对于维持牙齿的响应性和修复能力至关重要。本文介绍了一种光交联明胶甲基丙烯酰（GelMA）生物材料，该材料通过静电纺丝技术制备成具有临床应用功能的双层纤维支架。该支架由10%（w/v）的GelMA层组成，其中含有布洛芬（IBP，浓度为10%或20% w/w），用于调节免疫反应；另一层为20%的GelMA层，其中含有无定形磷酸镁（AMP，浓度为5%或15% w/w），以促进生物矿化。研究评估了纤维的形态、化学成分、机械性能、吸水性、酶解降解性以及IBP和Mg2?/PO?3?离子的释放动力学。通过人类牙髓干细胞（DPSCs）、巨噬细胞、LPS刺激的人工牙髓腔（APC）模型以及皮下植入实验来评估其生物活性。所有纤维均无颗粒且具有多孔性，光交联后表现出类似牙髓的硬度。含有IBP的纤维在初始阶段释放大量药物，随后持续释放14天；而含有AMP的纤维则持续释放离子7天。IBP层可降低IL-1α、TNF-α和IL-6的分泌水平，抑制NF-κB的激活，且无细胞毒性。AMP层可提高ALP活性、促进矿物质沉积，并增强COL1A1、RUNX2和ALPL基因的表达。在APC模型中，该双层支架在3小时内降低了IL1A、IL1B和TNF的水平；14天后，与LPS处理组相比，该支架上调了ALPL、DSPP和OCN的表达。皮下植入实验证实了其生物相容性：IBP降低了M1型巨噬细胞的极化程度，而AMP则短暂激活了RUNX-2基因，随后促进了ALP和骨钙素的表达，表明了矿化过程的发生。这种双层支架的双重功能使其成为一种有前景的下一代VPT生物材料，能够同时控制炎症并引导牙本质样组织的再生。

引言

牙髓炎通常是由于龋齿病变发展过程中细菌及其代谢产物通过牙本质小管扩散到牙髓腔引起的[1]。初期，炎症介质通过招募成牙本质细胞和间充质干细胞来替代受损的成牙本质细胞，从而恢复牙本质-牙髓复合体的动态平衡[1]。然而，如果炎症得不到抑制，牙髓组织将会退化，必须进行清除[1]。活髓治疗（VPT）旨在实现炎症与牙本质再生之间的平衡[2]，有望保留牙齿的固有响应性和修复机制，同时避免传统根管治疗的缺点（如牙齿脆性、变色和再感染）[2]。 目前用于VPT的氢氧化钙和硅酸钙制剂具有较高的临床成功率[3,4]。尽管这些材料能够诱导牙本质沉积（主要是通过病理性钙化），但它们无法消除牙髓组织的炎症[5,6]，因此目前仅适用于无症状、可逆性的牙髓炎病例。然而，鉴于牙髓的再生潜力，VPT可以作为一种独立于牙髓炎类型（可逆或不可逆）的治疗方法[7]。因此，下一代VPT材料应利用生物材料驱动的治疗平台，快速抑制炎症并促进前体细胞生成牙本质样组织[8]。 聚合物纳米纤维具有高度仿生的牙髓结构，有利于细胞黏附、增殖和分化[9]。明胶甲基丙烯酰（GelMA）作为一种多功能材料，在炎症环境中表现出良好的组织再生性能，因为它在遇到基质金属蛋白酶时会降解，从而有效释放所携带的治疗成分[10]。研究表明，光交联的GelMA纳米纤维可用于骨再生和预防微生物感染[11,12]。在VPT应用中，载有β-三钙磷酸盐的GelMA纤维能够支持人类牙髓干细胞的成牙本质分化，并在体内促进组织矿化[13]。 鉴于传统磷酸钙（如羟基磷灰石）的吸收速度较慢，探索新型生物陶瓷替代品可能带来更好的矿化效果[14]。最近的研究指出，由于其较高的生物降解性，镁（Mg2?）可作为钙（Ca2?）的替代品[15,16]。事实上，无定形磷酸镁（AMP）能够促进前成骨细胞的分化，并通过释放Mg2?来增强破骨细胞和成骨细胞的代谢[17]。此外，在载有DPSCs的生物打印细胞外基质水凝胶结构中添加AMP可提高矿化基质的分泌[18]。因此，在本研究中，我们首次验证了将AMP掺入GelMA纤维中是否能促进DPSC的分化，进而促进牙本质样组织的再生。 布洛芬（IBP）因其低成本和易获得性而成为最常用的非甾体抗炎药之一。临床研究表明，口服IBP可降低患有不可逆性牙髓炎的牙齿中促炎细胞因子PGE-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平[19]。然而，也有证据表明IBP会以剂量依赖的方式降低DPSC的干性并影响间充质细胞的矿化潜力[20,21]。因此，我们的第二个假设是：将IBP掺入GelMA纤维中可以有效减少炎症介质的水平[22]。基于其抗炎作用，同时考虑到IBP可能抑制细胞矿化的潜力，我们推测将其掺入GelMA纤维中既能减轻炎症，又能保持DPSC的活性。同时，我们预计AMP的加入还能促进成牙本质分化。因此，我们设计了这种双层支架，以同时解决炎症和再生的问题。

含有IBP或AMP的光交联GelMA纤维的制备

GelMA由猪皮来源的A型明胶（SLBM9945V，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）制备。首先，将A型明胶（浓度为10% w/v）溶解在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS，14190144，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）中。随后，在60°C条件下，使用自动泵（流速0.5 mL/min）向溶液中加入甲基丙烯酸酐（8 mL），并持续搅拌2小时。反应完成后，将溶液浓度加倍以终止反应。

形态学、化学和机械性能分析

扫描电子显微镜（SEM）对静电纺丝纤维的形态学分析显示，所有配方制备的纤维均为三维多孔结构，无颗粒且纤维方向随机分布。含有10% w/v GelMA的纤维平均直径较小，因为较高浓度的溶液会导致粘度增加，从而降低静电纺丝过程中的纤维拉伸程度（图1A-B）[29]。

结论

本研究证明，一种基于光交联GelMA的双层支架（包含释放布洛芬的层和含有无定形磷酸镁的层）能够同时抑制炎症并促进矿化组织的形成。该支架可实现布洛芬的快速释放，并在14天内持续释放布洛芬，显著降低LPS刺激的巨噬细胞中的NF-κB活性及促炎细胞因子IL-1α、TNF-α和IL-6的水平。 < RediT作者贡献声明 卡罗琳·安塞尔米（Caroline Anselmi）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、项目管理、方法设计、实验设计、数据分析、概念构思。 雷南·达尔-法布罗（Renan Dal-Fabbro）：撰写 – 审稿与编辑、方法设计、实验设计、数据分析。 希沙姆·阿巴达（Hisham Abada）：撰写 – 审稿与编辑、实验设计、数据分析。 伊戈尔·保罗尼诺·门德斯·索亚雷斯（Igor Paulino Mendes Soares）：撰写 – 审稿与编辑、方法设计、实验设计、数据分析。 莱斯·M·卡多佐（Lais M. Cardoso）：

致谢

作者感谢美国国立卫生研究院（NIH – 国家牙科与颅面研究所/NIDCR，资助编号R01DE031476）的财政支持。本文内容仅代表作者个人观点，不代表国立卫生研究院的官方立场。