一种通过级联调控机制实现的纳米辅助剂，用于抗原氧化和捕获，以增强原位癌症疫苗的效果

《Journal of Controlled Release》：A cascade-regulated nanoadjuvant for antigen oxidation and capture to potentiate in-situ cancer vaccination

本研究开发纳米佐剂DL/CDC，通过破坏肿瘤氧化还原平衡促进抗原硫醇化，并利用表面1,3-二酮基共价捕获硫基化抗原，实现高容量捕获（500μg蛋白/mg）和长效免疫刺激。实验表明该佐剂使树突细胞成熟度提升4.8倍，CD8+ T细胞浸润增加6倍，联合光热疗法使67%患者长期存活并形成持久免疫记忆。

　　

杨颖|林霞颖|丁思倩|宋晓宁|周战伟|孙敏杰

中国药科大学药学院药物制剂与辅料研究评价国家重点实验室，天然药物国家重点实验室，江苏省南京市同家庄24号，210009，中国

摘要

原位癌症疫苗中，抗原释放与免疫反应之间的相关性较差，因为释放的抗原在免疫细胞持续作用之前会迅速分散。我们假设共价捕获抗原可以通过将短暂的抗原暴露转化为持久的免疫刺激来克服这一限制。在这里，我们开发了一种名为DL/CDC的纳米佐剂，它可以选择性氧化肿瘤抗原，然后通过巯基化学方法捕获它们。DL/CDC通过Michael加成反应使细胞内谷胱甘肽消耗超过50％，从而破坏氧化还原平衡并加剧氧化应激。这种氧化环境将肿瘤抗原上的蛋白质巯基转化为巯基酸。表面连接的二酮基团通过亲核加成反应将这些巯基化抗原共价固定，每毫克DL/CDC的捕获能力约为500微克蛋白质。这种共价捕获机制使抗原在肿瘤部位的保留时间比游离抗原长7倍，并增强了淋巴结递送效果3倍，同时使树突状细胞成熟度提高了4.8倍，CD8⁺ T细胞浸润增加了6倍。结合光热疗法，DL/CDC实现了67％的长期生存率并产生了持久的免疫记忆。

引言

光热疗法或放疗后，肿瘤会释放大量肿瘤抗原，形成一个个性化的“抗原库”[[1], [2], [3]]。理想情况下，这些抗原可以直接作为原位疫苗，引发适应性免疫反应[4,5]。然而，大多数释放的抗原在遇到抗原呈递细胞（APCs）之前就会在肿瘤微环境中迅速降解或分散，导致短暂的抗原暴露与APCs的时空分布之间存在明显矛盾[6,7]。目前的增强策略，如APC趋化剂[[8], [9], [10], [11]]、刺激因子[[12], [13], [14]]或免疫检查点阻断[[15,16]]，通常是在抗原释放后实施的。这些方法不仅存在全身毒性的风险，而且错过了抗原可用的关键窗口[[17], [18], [19], [20], [21]]。因此，捕获抗原被认为是一种有前景的策略，可以增强原位疫苗的效果[[22], [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31]]。

最近对肿瘤微环境的了解揭示了其独特的氧化还原特征。在过量活性氧（ROS）或放疗引起的氧化应激下，抗原上的巯基会发生逐步的巯基化修饰，生成巯基（Cys-SOH）、亚砜基（Cys-SO₂H）或磺酸基（Cys-SO₃H）等中间体[[32], [33], [34], [35], [36]]。这一病理特征为选择性捕获抗原提供了分子基础。通过破坏肿瘤的氧化还原平衡来增强这种巯基化特征已成为一种合理的方法。具体来说，谷胱甘肽（GSH）清除剂[[37,38]]或氧化剂前体[[39,40]]可以耗尽细胞内的GSH，降低其抗氧化缓冲能力并加剧氧化应激。这种“氧化风暴”促进了肿瘤抗原的广泛巯基化，扩大了可捕获的目标范围。

在这里，我们开发了一种新型的DL/CDC佐剂，利用这种氧化还原脆弱性在原位诱导和捕获巯基化抗原。DL/CDC是通过将1,3-二酮修饰的脂质体（DL）与肉桂醛衍生的囊泡（CDC）融合而成的，形成一个能够选择性调节肿瘤氧化还原的统一系统（图1a）。该系统通过与α, β-不饱和羰基的反应耗尽细胞内GSH（>50％），导致ROS迅速积累，并使巯基化蛋白质的修饰水平提高到基线的1.9倍。同时，表面连接的3,5-环己二酮基团具有活化的1,3-二羰基碳，可以通过亲核反应捕获带有亲电巯基残基的巯基化肿瘤抗原，形成不可逆的CS硫醚加合物，同时释放水，从而维持抗原的保留[[41], [42], [43], [44], [45]]。这一过程实现了高容量的抗原捕获（约500微克蛋白质/毫克DL/CDC），将重点从抗原释放转移到原位抗原的保留和稳定上（图1b, c）。结果，树突状细胞成熟度提高了4.8倍，CD8⁺T细胞浸润密度增加了6倍，共同增强了抗肿瘤免疫反应。

材料与试剂

DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂购自上海Ponsure Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）。DSPC购自Avanti Polar Lipids, Inc.（美国阿拉巴斯特，AL）。1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、二乙胺和胆固醇购自Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国上海）。3,5-二氧环己烷羧酸（DCHA）和肉桂醛购自Bidepharm Co., Ltd.（中国上海）。

DL/CDC佐剂的制备与表征

DL/CDC佐剂是通过融合两种在组成和功能上不同的纳米载体：DL脂质体和CDC囊泡制备的（图2a）。DL脂质体是通过乙醇注射制备的，使用DSPC、胆固醇和DSPE-PEG₂₀₀₀-DCH以60/35/5的摩尔比混合。DSPE-PEG₂₀₀₀-DCH是通过DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂与DCHA之间的酰胺键形成合成的，通过¹H NMR（PEG/NH比例约为182:1）、¹³C NMR（烯醇碳在δ 103.07 ppm）和FT-IR确认了成功的结合

讨论与结论

本研究旨在利用肿瘤微环境的氧化还原特性，建立一种新的原位癌症疫苗设计原理，以实现抗原修饰和选择性捕获。为此，我们开发了一种DL/CDC纳米佐剂系统，该系统通过耗尽GSH、氧化修饰肿瘤抗原以及共价捕获修饰后的抗原来发挥作用。我们的发现表明，DL/CDC不仅在氧化应激下增强了抗原的免疫原性，而且

CRediT作者贡献声明

杨颖：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，研究，数据分析，概念化。林霞颖：可视化，验证，方法学。丁思倩：验证，方法学。宋晓宁：验证。周战伟：撰写 – 审稿与编辑，概念化。孙敏杰：项目管理，数据分析，概念化。

利益冲突声明

作者声明与本工作无关的利益冲突。

致谢

本工作得到了长江三角洲技术创新社区联合研究项目（2023CSJZN0800）对M.S.的支持；江苏省重点研发计划社会发展项目（BE2023845）对M.S.的支持；以及国家自然科学基金（82102202）对Z.Z.的支持。