TIPIN调控ATM依赖性检查点与NF-κB信号通路协同应对拓扑异构酶抑制诱导的DNA复制损伤

《Communications Biology》：TIPIN coordinates ATM-dependent checkpoint and NF-κB signaling to counteract DNA replication damage from topoisomerase inhibition

本研究针对拓扑异构酶抑制剂抗癌治疗中DNA复制相关双链断裂(DSBs)触发的细胞命运抉择机制，揭示了复制叉保护复合体关键组分TIPIN作为ATM信号通路的枢纽分子，通过协调DNA损伤修复与NF-κB介导的生存信号传导，首次阐明TIPIN磷酸化招募MDC1促进c-FLIP上调进而抑制caspase-8活化的新通路，为克服基因毒性疗法诱导的衰老耐药提供了新型靶向策略。

　　

在抗癌治疗领域，拓扑异构酶抑制剂通过稳定酶-DNA复合物引起DNA复制叉碰撞，产生独特的一端双链断裂，从而有效杀伤癌细胞。然而，这种基因毒性压力往往触发细胞进入可逆的生长停滞状态——治疗诱导性衰老（TIS），使得癌细胞能够逃避初始药物毒性，并以更具侵袭性的方式重新增殖，最终导致治疗耐药和疾病复发。因此，解析DNA复制应激背景下细胞命运决定的分子机制，对于提高基因毒性疗法的疗效至关重要。

ATM丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶作为DNA损伤应答的核心调控因子，通过磷酸化关键底物协调细胞周期检查点、DNA修复和凋亡等多种应激反应。此外，ATM还参与核因子κB（NF-κB）信号通路的激活，这一转录程序控制着衰老相关分泌表型基因表达和基因毒性应激触发的衰老建立。然而，在基因毒性治疗下，细胞如何调控ATM依赖的多方面应答以决定生存与死亡之间的命运，仍然很大程度上未知。

发表在《Communications Biology》的这项研究由Arafat Khan等研究人员完成，他们发现复制叉保护复合体的关键组分TIPIN在协调ATM信号传导中发挥核心作用。研究团队通过系列实验证明，TIPIN不仅作为ATM信号的调节因子，其本身也是ATM的磷酸化底物，从而整合DNA复制相关DSB信号传导。靶向TIPIN介导的核内ATM-NEMO信号能够通过抑制NF-κB激活来削弱抗凋亡能力，从而对抗TIS并增强基因毒性治疗的细胞毒性效应。

研究主要采用了以下关键技术方法：利用siRNA介导的基因敲低技术特异性调控TIPIN、MDC1等靶点表达；通过蛋白质印迹分析信号通路关键蛋白磷酸化水平；采用免疫荧光染色和邻近连接实验检测蛋白定位与相互作用；使用DNA纤维追踪技术评估复制叉动态；通过流式细胞术分析细胞衰老和凋亡；结合质谱分析鉴定TIPIN相互作用蛋白；在结直肠癌细胞模型中验证MDC1靶向的化疗增敏效果。

特异性敲低FPC中的TIPIN损害细胞对Top1抑制的DSB应答

研究人员发现，当使用两种独立siRNA敲低U2OS细胞中的TIPIN时，会导致拓扑异构酶I抑制剂喜树碱处理后CHK2磷酸化和RPA32 S4/S8磷酸化水平降低，而RPA32 S4/S8磷酸化是DNA末端切除和ssDNA形成的标志。相反，TIPIN敲低并不影响对拟辐射化合物新制癌菌素的DSB应答。值得注意的是，TIM敲低产生了与TIPIN敲低相反的效果，表现出ATM激活、KAP1磷酸化以及pRPA32及其焦点形成的增加，代表加剧的复制叉断裂和增强的DDR信号。

通过滴定siRNA TIPIN#1的转染量，研究人员发现其抑制pRPA32诱导的能力在中间浓度时最佳。具体而言，过强的TIPIN敲低会耗尽TIM，导致全局复制叉不稳定和pRPA32诱导增强，而较弱的敲低效率则会使与TIPIN缺陷相关的表型丧失。因此，TIPIN敲低特有的表型只有在TIM稳定性得到保留时才显现。

TIPIN是放大ATM信号促进DSB修复所必需的

研究显示，TIPIN通过促进ATM依赖性DSB信号传导来放大MRN复合物依赖的ATM激活。当细胞用喜树碱脉冲处理1小时后释放，观察到ATM信号立即激活，随后pRPA32 S4/S8逐渐增加，代表DPC去除和DNA末端切除。蛋白酶体抑制剂MG132或ATM激酶抑制剂KU-60019能有效阻断喜树碱处理后的DSB信号和pRPA32 S4/S8诱导。同样，TIPIN敲低也损害了这些DSB相关信号通路，包括ATM激活，表明TIPIN促进ATM依赖性DSB信号传导。

研究人员还观察到TIPIN敲低导致RAD51焦点形成显著减少，这是同源重组的功能标志，表明DSB修复受损。中性彗星实验也揭示了TIPIN敲低细胞中DSBs增加。这些数据共同表明，TIPIN是ATM信号激活和放大所必需的，从而促进复制相关DSBs的下游切除和修复过程。

TIPIN是ATM激酶的下游靶标并被磷酸化

研究团队在TIPIN的C末端鉴定了一个S/TQ共识基序，该位点可作为ATM/ATR依赖性磷酸化的靶点，并在高等脊椎动物中保守。他们制备了特异性识别TIPIN S222磷酸化的抗体，能够在喜树碱处理后检测到TIPIN S222的磷酸化，这与ATM-CHK2激活同步但先于NEMO S85磷酸化。这种磷酸化特异性地依赖于ATM，而不依赖于ATR或DNA-PKcs。

通过CRISPR/Cas9敲入方法将内源性TIPIN的丝氨酸222替换为丙氨酸，获得的纯合敲入克隆表现出与亲本细胞系相似的细胞周期分布。与Retro-X系统结果一致，ATM信号在TIPIN S222A细胞中对喜树碱的应答并未受损，进一步支持TIPIN磷酸化不直接影响上游DSB信号传导。此外，S222A细胞在Top1cc DPC去除方面没有缺陷，喜树碱处理的WT和S222A细胞之间的RAD51焦点形成相当。

TIPIN磷酸化促进MDC1依赖的NF-κB通路激活

研究表明，TIPIN修饰与基因毒性应激依赖性NF-κB信号传导激活相关。ATM抑制剂处理可阻止NF-κB信号在U2OS细胞中的激活，而TIPIN敲低则损害了NF-κB及其上游调节因子IKKα/β的磷酸化。在TIPIN S222A敲入细胞中，NF-κB信号传导受损，特别是NEMO S85磷酸化水平降低，表明TIPIN磷酸化是促进NF-κB信号传导所必需的。

通过免疫沉淀-质谱分析，研究人员发现MDC1与磷酸化TIPIN特异性相互作用。MDC1敲低导致喜树碱和新制癌菌素处理后pNF-κB和pIKKα/β减少，表明MDC1是促进DNA损伤诱导NF-κB信号传导所必需的。此外，TIPIN或MDC1敲低抑制了NF-κB的转录激活。重要的是，在表达TIPIN S222A的细胞中，MDC1在停滞复制叉处的定位显著降低，支持TIPIN磷酸化对于在停滞复制叉处富集MDC1是必要的观点。

破坏ATM-TIPIN-MDC1信号轴使细胞对Top1抑制诱导的凋亡敏感

鉴于NF-κB通路在建立TIS和防止细胞死亡中的促生存作用，研究人员测试了破坏ATM-TIPIN-MDC1信号是否会对抗NF-κB信号传导，从而导致Top1抑制的化疗增敏。用NF-κB抑制剂BAY 11-7082处理细胞足以抑制Top1抑制诱导的NF-κB激活，这导致衰老相关β-半乳糖苷酶活性诱导减少，以及凋亡增加。

这种细胞命运的改变在MDC1敲低条件下得到重现。相反，TIPIN敲低导致凋亡增加，使细胞在喜树碱处理下超敏化。研究人员观察到喜树碱处理后c-FLIP上调，而抗凋亡BCL-2家族蛋白BCL-XL和BCL-2的表达基本不受影响。c-FLIP的转录上调依赖于NF-κB信号传导，即MDC1和NEMO。长时间喜树碱处理导致procaspase-8切割，TIPIN或MDC1敲低加剧了这一过程，导致下游效应caspase-3激活增加。

MDC1是伊立替康治疗结直肠癌的化疗增敏靶点

最后，研究人员验证了TIPIN-MDC1信号在癌症治疗中的化疗增敏相关性。在HCT116结直肠癌细胞中，MDC1缺陷足以抑制SN-38诱导的pNF-κB和pNEMO激活，并导致SN-38上调的c-FLIP表达抑制。MDC1缺陷的HCT116细胞表现出更快和更高的caspase-8和caspase-3激活，相应地，在MDC1敲低的HCT116细胞中，细胞死亡增强。

研究还发现，在p53缺陷的HCT116细胞中，MDC1敲低导致的凋亡增强更为明显，这表明大多数p53缺陷的结直肠癌在外部c-FLIP/caspase-8轴受到扰动时可能对治疗有更好反应。因此，靶向NF-κB信号传导中的TIPIN-MDC1通路可能使细胞对伊立替康治疗敏感，而不受p53状态的影响。

本研究系统阐明了TIPIN在协调ATM依赖性检查点和NF-κB信号传导中的核心作用，从而决定拓扑异构酶抑制背景下癌细胞的命运抉择。除了TIPIN作为复制叉保护复合体组成部分在确保活跃复制叉处复制体高效进展和促进复制应激下ATR依赖性CHK1磷酸化方面的已知角色外，该研究提出TIPIN作为复制相关DSBs应答中ATM通路的调节组分。TIPIN放大MRN依赖性ATM激活，促进RPA32磷酸化和DNA末端切除，以修复停滞复制叉处的DSBs。ATM激活后，TIPIN被磷酸化，这有助于连接ATM依赖性NF-κB激活。

该研究确定了几个新的调节因子，它们决定了对拓扑异构酶抑制剂的化疗反应，从而决定癌细胞的命运。第一个是MDC1，它直接通过其BRCT和FHA磷酸结合域识别γH2AX和ATM，并作为适配体调节DDR因子在DSBs位点的焦点形成。本研究揭示了TIPIN和MDC1在停滞复制叉处的相互作用，促进了ATM依赖性NF-κB激活。虽然人类复制体的冷冻电镜结构不包括TIPIN S222磷酸化发生的C末端区域，但TIM-TIPIN复合体在复制体前缘的位置暗示TIPIN的C末端应从复制体突出。这种配置突出了TIPIN作为首先遇到复制叉前障碍物的响应者，以传播ATM信号，而其修饰可能将MDC1带到一端DSBs以连接NF-κB信号传导。

NF-κB信号传导在基因毒性应激下被认为是促生存的，因为它允许临时激活癌细胞生存所需的基因，为DNA修复提供机会。这种转录程序也涉及与TIS相关的细胞因子反应，这解释了化疗耐药和疾病复发。研究表明，MDC1缺陷导致TIS诱导减少，但凋亡性细胞死亡增加，表明TIPIN依赖性MDC1调节通过调节NF-κB通路在影响生存与死亡之间的平衡中发挥关键作用。因此，靶向MDC1或理想地破坏TIPIN-MDC1相互作用可能是一种化疗增敏方法，以抑制TIS并降低DSB诱导癌症治疗中凋亡的阈值。

该研究确定的另一个调控层是潜在拓扑异构酶抑制细胞毒性的c-FLIP/caspase-8轴，它决定凋亡的发生。c-FLIP是死亡受体介导的外部凋亡通路的主要抑制因子。c-FLIP与procaspase-8异源二聚化，在FADD含有的死亡诱导信号复合物中，在死亡配体接合时阻断caspase-8激活。c-FLIP也与名为ripoptosome或复合体IIb的胞质信号平台相关，该平台包含procaspase-8、FADD和受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶1以激活caspase-8依赖性凋亡。在这方面，c-FLIP被认为是化疗耐药和多种癌症预后不良的主要因素。

本研究确定复制体本身是通过调节ATM信号传导对抗复制阻断基因毒性方案化疗敏感性的关键决定因素。在这方面，TIPIN修饰或MDC1水平可能呈现新的药物敏感性生物标志物。进一步表征基因毒性应激诱导的NF-κB和caspase-8通路之间的交叉对话将有助于制定靶向MDC1或c-FLIP的策略，以及与标准化疗联合的新调节因子，如TIPIN-MDC1相互作用，以增强抗癌治疗的有效性。