RNA结构优化驱动大肠杆菌L-天冬酰胺酶高效生物合成：合成基因策略突破产量瓶颈

《Applied Biochemistry and Microbiology》：Optimization of RNA Structure Leads to Increased Biosynthesis of E. coli L-asparaginase when its Gene is Overexpressed

为破解临床L-天冬酰胺酶（EcA2）供应不足、成本高昂的难题，研究者设计合成基因弱化mRNA 5′-端发卡结构，使BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN在摇瓶中产酶达291 mg L?1，较天然基因提升50%，终产品符合药典纯度且收率≥25%，为国产抗癌生物类似药降本增效提供即刻可用的表达平台。

　　在儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）标准化疗方案里，L-天冬酰胺酶（L-asparaginase, EC 3.5.1.1）通过耗尽血浆L-天冬酰胺（L-Asn）选择性扼杀肿瘤细胞，已被WHO列入基本药物清单40余年。然而全球原料药几乎依赖欧美少数厂商，进口价高、断供风险大；国内至今无国产EcA2原研或生物类似药上市。提高产量、降低成本、保证药典级纯度，成为关系国家药品安全与患者可及性的“卡脖子”问题。传统思路尝试更换宿主或添加融合标签，但产量仍徘徊在百毫克每升级，且伴随内毒素高、纯化步骤繁琐等新痛点。Shayfutdinova等跳出现有框架，提出“不改氨基酸、只改RNA结构”的假设：若通过同义密码子替换削弱mRNA 5′-端稳定发卡，核糖体更易结合翻译起始区（TIR），理论上即可大幅提升EcA2合成速率而无需额外工艺投入。

为验证该设想，研究团队以大肠杆菌BL21[DE3]为底盘，保持天然信号肽及pET28a载体不变，仅对ansB基因进行计算机辅助设计：去除长反向重复序列，把5′-端30-300 nt区段结构自由能从-70 kcal mol?1调松至-47 kcal mol?1，同时把高度偏好密码子比例由“中低”区间挪至“80-100”区间，CAI自0.79微升至0.80。合成基因由SYNBIO公司合成后构建质粒pET28a-AsnSYN，与携带天然基因的pET28a-AsnWT平行比较。摇瓶水平1 mM IPTG诱导3 h，前者胞外+胞内总活性蛋白达291±9 mg L?1，后者仅194 mg L?1，提升约50%；比生产率亦由29.9 mg (L?AU)?1增至44.5 mg (L?AU)?1。继续优化下游五步层析（酸沉、Capto S、Capto DEAE、Phenyl HP、CHT羟基磷灰石），终产品收率≥25%，比活性＞250 IU mg?1，SDS-PAGE未见杂带，尺寸排阻显示多聚体＜3%，宿主蛋白残留与DNA均低于行业指南，内毒素8.5 EU mg?1，符合欧洲药典对注射级L-天冬酰胺酶的要求。

关键技术方法（≤250字）：合成基因设计结合RNAfold在线服务器预测mRNA二级结构；以pET28a(+)构建T7启动子驱动表达质粒；热激法转化BL21[DE3]与低内毒素ClearColi BL21(DE3)获得产酶菌株；TB培养基IPTG诱导后超声破菌，离心分溶/不溶相；改良Mashburn-Wriston微孔板法测酶活；多步层析联用制备药典级蛋白；SEC与RP-HPLC评估纯度及多聚体；qPCR与ELISA分别定量残留宿主DNA与HCP；LAL显色法检测内毒素。

研究结果：

1. 合成基因设计与mRNA结构预测
   计算机模拟显示，SYN基因5′-端 ensemble 自由能显著升高，最稳定发卡概率由>80%降至<50%，TIR暴露度增加。
2. 表达水平比较
   21 h诱导后，SYN株总酶浓度、比酶浓度均显著高于WT株（p=0.005, p<0.001），而菌体OD600无差异，说明提升并非因生长优势。
3. 不同宿主评价
   ClearColi因LPS改造导致生长慢、胞外泄漏严重，21 h酶产量仅为BL21[DE3]的40%左右，且LAL测试仍呈阳性，故未继续采用。
4. 纯化与质量解析
   五步层析后纯度>95%，回收率37%，比活性、多聚体比例、宿主残留均达到参考药品Spectrila同等水平。
5. 分析方法验证
   微孔板法线性范围0.01-20 IU mL?1，CV<5%，可同时测96样，适用于工艺过程监控。

研究结论与讨论：文章首次证明，仅通过“弱化5′-端RNA发卡”这一简约策略即可让大肠杆菌自身EcA2表达量提升50%，且不需更换载体、信号肽或诱导条件，避免额外工艺验证成本。该思路对其它同源高价值蛋白的过量表达具有普适启示；同时，研究亦指出ClearColi并非万能低内毒素解决方案，其生长慢、产物外泄及LAL假阳性问题需综合权衡。凭借高产量、药典级质量与简易纯化路线，BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN系统可直接放大至发酵罐规模，为俄罗斯乃至全球提供经济、安全、可持续的L-天冬酰胺酶生物类似药生产路线，也为中国实现国产化提供了可复制的技术模板。