新型EBV阴性人类I型自然杀伤T细胞系NKT617的建立及其多维度特性分析

《Laboratory Investigation》：Establishment and Multidimensional Characterization of a Novel EBV-negative Human Type Ⅰ Natural Killer T Cell Line NKT617

NKT617细胞系来源于急性T-LGLL患者外周血，经长期培养（>100代）稳定增殖，表现为CD56+、CD2+、CD4+等NKT细胞特征，并证实其具有αβ TCR Vα24-Jα18重排。该细胞系为首个EBV阴性人源I型NKT细胞永生化模型，在体内外均显示肿瘤形成能力，为NKT细胞发育及CAR-T疗法研究提供可靠工具。

　　

李晨成|刘西西|张卫光|杨静|张晓丽|贾纳蒂·雷艾拉|姜鹏军|田芳|陈碧清|朱学军

南京中医药大学附属医院/江苏省中医院血液科，中国江苏南京210029

摘要

NKT细胞是一类独特的T淋巴细胞亚群，其发育和功能调控机制仍不完全清楚。经过充分研究的永生化细胞系是体外研究NKT细胞生物学的重要工具。我们建立并维持了一个新的NKT细胞系NKT617，该细胞系来源于一名患有侵袭性大颗粒淋巴细胞白血病的患者的外周血。通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜评估了细胞形态，流式细胞术分析了细胞表型，而TCR克隆基因重排确定了细胞谱系。RNA测序比较了NKT617与其他血液肿瘤细胞系（如NK细胞、T细胞、B细胞和单核细胞）的基因表达谱。通过体外克隆形成实验和体内斑马鱼异种移植模型评估了其致瘤潜力。NKT617已连续培养超过两年，传代次数超过100次，表现出单克隆永生化特性。该细胞系在低剂量重组人IL-2的作用下增殖，并以单个细胞或聚集体的形式在悬浮培养中生长。流式细胞术分析显示，NKT617具有NK细胞表型（CD56+、CD158a+、Nkp46+），同时具有T细胞的特征（cCD3+、CD2+、CD4+、CD8+、CD45RA+、CD45RO+），并存在TCRβ克隆重排。NKT617不表达B细胞和髓系标记物，但表达TCRα链（Vα24-Jα18），证实其属于I型NKT细胞。转录组分析显示其具有与NK细胞和T细胞系共有的标记物，但基因表达谱更接近NK细胞。体外和体内实验均证实了其致瘤能力。我们报道了首个EBV阴性的I型人类NKT细胞系NKT617，该细胞系为研究NKT细胞发育和推进基于嵌合抗原受体的疗法提供了重要基础。这一细胞系是探索NKT细胞生物学和开发靶向免疫疗法的宝贵工具。

引言

截至2010年，已有637个符合严格认证标准的白血病/淋巴瘤细胞系被建立，其中23个来源于成熟T细胞，11个来源于自然杀伤（NK）细胞，包括YT⁴、NK-92⁵、NKL⁶、HANK-1⁷、NK-YS⁸、KHYG-1⁹、SNK-6¹⁰、MOTN-1¹¹、IMC-1¹²、PLT-2¹³、NK3.3¹⁴。在接下来的十年中，又开发了更多NK/T细胞系，如NKG¹⁵、NK101¹⁶、ZQNK-29¹⁷、AML-004¹⁸和ENKL-J1¹⁹。尽管对T细胞和NK细胞的理解取得了显著进展，但非传统T细胞（如NKT细胞）的分化、发育和功能调控机制仍不完全清楚。

人类淋巴细胞库的多样性使得区分T细胞和NK细胞变得复杂。研究淋巴细胞生物学的一个关键挑战在于T细胞和NK细胞之间的表型标记物存在重叠。例如，传统上与NK细胞相关的受体NKG2D、2B4和NKp80也表达在γδ T细胞和某些αβ T细胞上。同样，CD16和CD56通常被认为是NK细胞的标志物，但缺乏特异性，因为像NKT细胞、黏膜相关不变T（MAIT）细胞和γδ T细胞这样的亚群对这些标记物的表达具有差异性。NKT细胞介于先天免疫和适应性免疫之间，具有混合的T/NK细胞特征，但其研究受到两个主要障碍的阻碍：难以分离纯化的NKT亚群以及缺乏可靠的NKT细胞系模型。现有的细胞系MOTN-1¹¹和PLT-2¹³（分别来源于慢性及转化期CD56+ T细胞大颗粒淋巴细胞白血病（T-LGLL）患者），AML-004¹⁸（来源于髓系NK细胞急性白血病患者）仅表现出部分NKT样特征；而NK-YS⁸、SNK-6¹⁰、HANK-1⁷和ENKL-J1¹⁹等细胞系则来源于结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤（鼻型）患者，并且依赖于EB病毒（EBV）感染。

在这里，我们描述了NKT617的建立和特性分析，这是一种来源于患有侵袭性T-LGLL（伴有白细胞增多和快速进展）患者的新型永生化NKT细胞系。NKT617在体外已稳定维持超过两年，表现出单克隆永生化特性和IL-2依赖性增殖。重要的是，这个无EB病毒污染、微生物学上纯净的细胞系具有典型的NKT细胞特征，为研究NKT细胞生物学和开发治疗策略提供了独特的可靠模型。

供体患者的临床背景

一名64岁的亚洲女性因多个淋巴结肿大、肝脾肿大、白细胞计数升高以及颗粒淋巴细胞显著增加而入院。对外周血的流式细胞术分析显示，存在异常的淋巴细胞群，其免疫表型为：CD56+、CD16?、CD2+、CD7+、膜CD3?、胞质CD3+。对循环肿瘤细胞进行的免疫组化检测显示EBER阴性、TIA-1阳性。

NKT617的建立和形态学特征

通过患者外周血的初次培养和连续传代，我们建立了一个新的侵袭性大颗粒淋巴细胞白血病细胞系，命名为NKT617。短串联重复（STR）DNA分析证实NKT617与供体原始外周血细胞在基因上完全一致（补充图S1），从而确认了其真实的患者来源。通过与Cellosaurus数据库的比对，确认了NKT617的新颖性，因为没有找到匹配的STR序列。

讨论

NKT细胞是一类非传统的T细胞，它们表达αβ T细胞受体来识别抗原，同时具有NK细胞的功能和表型特征。根据TCR的多样性和抗原特异性，NKT细胞大致分为I型和II型亚群。人类iNKT细胞的特点是表达CD161（NK1.1）、CD56和NK相关受体，通常通过针对不变序列Vα24-Jα18的TCR特异性单克隆抗体进行鉴定。

作者贡献

CCL：正式分析、撰写初稿。XXL：验证、正式分析、撰写初稿。XLZ和Reaila：方法学设计、资源提供。PJJ：方法学设计、资源提供。JY：方法学设计、正式分析。WGZ：方法学设计、正式分析。FT：撰写、审稿和编辑。BQC：项目管理、验证、监督、分子分析、实验设计。XJZ：概念构思、方法学设计、验证、项目管理、正式分析、监督、资源提供、实验设计。

数据可用性声明

本研究中使用和/或分析的数据集可向相应作者提出合理请求后获取。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号82001206和81673771）、国家重点医学免疫学实验室开放项目（编号NKMI2021K18）、江苏省中医院高层次学术人才发展计划（编号y2021rc42）、江苏省科学技术发展计划-临床前沿技术（编号BE2016809）以及江苏省研究生研究与实践创新计划的支持。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

伦理批准和参与同意

作者对工作的所有方面负责，确保与工作准确性或完整性相关的问题得到适当调查和解决。所有涉及人类参与者的实验程序均符合机构和国家研究委员会的伦理标准以及2013年修订的赫尔辛基宣言。本研究已获得患者捐赠者的书面知情同意。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本论文的过程中，作者使用了DeepL（https://www.deepl.com/translator）和ChatGPT来改进语言和翻译。使用这些工具/服务后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。

未引用的参考文献

5.; 14.; 17.; 18.; 5.; 14.; 17.; 18..