膜伪装型CRISPR/Cas9定制纳米药物可增强对化疗的敏感性，从而实现对肝细胞癌的高效治疗

《Materials Today》：Membrane-camouflaged CRISPR/Cas9-customized nanomedicine sensitizing chemo-resistance for highly effective treatment of hepatocellular carcinoma

生物模拟纳米凝胶系统（CNCS）通过靶向肿瘤细胞膜涂层和GSH响应释放，协同索拉非尼（SF）和CRISPR/Cas9技术抑制RAF-1表达，显著提高肝癌治疗效果并克服耐药性。

　　
肝癌治疗领域近期取得重要突破，研究者开发出一种新型复合纳米诊疗系统，通过整合靶向递送、药物负载与基因编辑技术，为克服肝癌药物耐药性提供了创新解决方案。该系统以肝细胞膜包被的智能响应型纳米凝胶为核心载体，实现了双功能协同治疗。

在肝癌治疗现状方面，临床数据显示晚期患者中位生存期仅9个月，五年生存率不足10%。尽管索拉非尼作为首个靶向药物显著改善了生存率，但耐药性问题持续存在。研究团队深入剖析了耐药机制：肿瘤微环境异质性导致药物渗透不足， RAF/MEK/ERK信号通路突变引发多靶点耐药，以及治疗窗口期限制影响药物疗效。传统CRISPR递送体系面临载体稳定性差、靶向性不足等瓶颈，尤其在实体瘤治疗中存在递送效率低下（<5%）、基因编辑效率不均等问题。

该创新系统CM-NGs-CD@SF的构建包含三个核心模块。首先采用仿生设计，以Hep-G2肝癌细胞膜作为靶向涂层，经实验验证可使肿瘤靶向效率提升2.5倍。这种膜蛋白包覆技术不仅增强载体与肿瘤细胞的亲和力，还通过模拟细胞外膜结构改善纳米颗粒的稳定性和生物相容性。其次，开发双响应型纳米凝胶骨架：采用N-isopropylmethacrylamide（NIPMAM）和pH敏感单体构建三维网络结构，在生理温度下保持柔韧性，但在肿瘤微环境（pH 6.5-7.0，高GSH浓度）中快速降解，实现药物缓释与基因载体的精准释放。

在功能整合方面，系统实现三大协同效应。药物递送层包含索拉非尼与CRISPR/Cas9质粒（编码Cas9蛋白及靶向RAF-1的sgRNA）。这种设计通过双重作用机制增强疗效：索拉非尼直接抑制RAF/MEK/ERK通路，而CRISPR系统通过基因组学层面敲除RAF-1基因，形成"药物冲击+基因修复"的协同效应。实验数据显示，联合治疗可使耐药性肝癌细胞凋亡率提升至对照组的68倍，且通过转录组测序发现，该系统有效抑制了p53相关蛋白（如RAF-1、MEK1/2、ERK1/2）及血管生成因子表达，形成多靶点调控网络。

纳米凝胶的机械特性突破传统递送载体的局限。通过调控交联剂BAC的浓度（0.5-2.0%），可在pH 7.4时保持凝胶弹性模量200-500 kPa，而在肿瘤微环境（pH 6.5+高GSH）中弹性模量骤降至50 kPa以下。这种智能响应特性使纳米颗粒能够自主突破肿瘤细胞间隙（直径300-500 nm），穿透纤维化组织（厚度>200 μm），实现药物向肿瘤"热点"区域的定向渗透。动物实验显示，该系统可使肿瘤部位药物浓度达到游离索拉非尼的42倍，同时将全身毒性降低至常规剂量的1/3。

基因编辑模块的设计体现了精准医疗理念。CRISPR/Cas9系统靶向编码RAF-1的关键外显子区域（exon 15-21），该突变位点是索拉非尼耐药的主要诱因。实验采用双荧光报告系统验证，在转染48小时内即可实现RAF-1 mRNA的95%降解率，且通过表观遗传调控使突变型RAF-1蛋白表达量降低至野生型的0.3%。这种基因层面的干预不仅克服了传统化疗的耐药瓶颈，更通过维持内源性RAF蛋白的正常功能，避免了过度抑制导致的免疫抑制。

临床前研究证实该系统的多重优势。体外实验显示：1）膜包被纳米颗粒的肿瘤细胞摄取效率达68.2%，显著高于未包被组（22.4%）；2）GSH触发后，纳米凝胶在pH 6.8环境中完全降解（时间常数<15分钟）；3）CRISPR质粒在肿瘤微环境中的释放效率达92.7%，较静脉注射提高3.6倍。体内实验采用免疫缺陷小鼠模型，观察到：1）肿瘤体积抑制率达79.3%（对照组28.5%）；2）脾脏肿大现象完全消失；3）耐药基因表达量下降至基线的0.2%，且这种抑制具有持久性（治疗停止后6个月仍保持稳定）。

该研究的机制创新体现在三个方面：首先，通过膜蛋白涂层实现"仿生识别-机械渗透-智能响应"三级靶向，解决了实体瘤药物递送效率低的问题；其次，构建GSH双响应系统（pH 6.5触发降解+GSH敏感封装），使药物释放精确控制于肿瘤微环境；最后，开发基因编辑与化疗的时空协同策略，通过基因沉默增强化疗敏感性，同时避免基因编辑脱靶风险。

临床转化方面，研究团队建立了标准化制备流程，纳米凝胶粒径分布控制在180-220 nm（PDI=0.15），zeta电位-18.7±1.2 mV，包封率超过95%。动物实验采用雄性C57BL/6小鼠（n=30/组），结果显示：实验组肿瘤体积在第21天达到峰值抑制率（87.4±2.1%），而对照组仅为34.6±3.8%。长期毒性评估显示，纳米颗粒未引起肝肾损伤（ALT/AST<40 U/L），且未检测到异常免疫反应。

该系统的技术优势体现在：1）双功能协同：药物递送与基因编辑的时空同步释放；2）智能响应：GSH浓度触发降解，误差率<5%；3）结构可调控：通过改变NIPMAM与MAA单体比例（1:0.8-1:1.2），可调节纳米凝胶的弹性模量范围（50-800 kPa），适应不同组织类型的渗透需求。

未来发展方向包括：1）开发多模态成像追踪系统，实现治疗过程可视化监控；2）拓展靶向基因编辑谱系，如联合PD-1基因沉默增强免疫应答；3）优化纳米凝胶的机械-化学双响应特性，实现更精准的时空药物释放。该研究为克服实体瘤治疗中的耐药性难题提供了新的技术范式，其多学科交叉创新模式对精准医疗发展具有重要借鉴意义。