在Populus alba × Populus glandulosa杂交种中全基因组范围内鉴定TGA转录因子家族，并对PagTGA7b在耐盐性中的功能进行验证

盐胁迫响应中杨树TGA转录因子家族的鉴定与功能解析。

　　
84K杨树TGA转录因子家族的鉴定及其在盐胁迫响应中的功能解析

一、TGA转录因子家族的生物学意义与研究现状
TGA转录因子作为bZIP结构域转录因子家族的重要成员，在植物逆境响应中发挥核心调控作用。这类蛋白通过识别并结合DNA序列中的TGACG基序，调控下游抗逆相关基因的表达。研究显示，TGA转录因子在植物应对盐、旱、冷等多种非生物胁迫过程中，通过整合水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）和乙烯（ET）等激素信号通路，协调抗氧化系统与离子稳态的维持。例如，拟南芥AtTGA2通过激活SA信号通路增强抗病性，而杨树中发现的GmTGA15基因过表达显著提升ABA含量，进而增强盐胁迫耐受性。

二、84K杨树TGA转录因子的系统生物学解析
1. 家族成员的鉴定与进化特征
通过基因组比对和结构域特征分析，在84K杨树（Populus alba × Populus glandulosa）中鉴定出20个TGA转录因子（PagTGA），均具备完整的bZIP和DOG1结构域。系统发育分析将其划分为五类亚群（Group I-V），其中Group II包含9个成员，占总量45%，与已知的抗逆调控核心亚群高度吻合。

2. 基因结构特征与重复模式
PagTGA基因平均含14.2个外显子和12.3个内含子，呈现典型的家族特征：同一亚群基因具有高度保守的顺式作用元件分布模式，如Group II成员普遍含有ABRE（ABA响应元件）和ARE（活性氧响应元件）的富集。基因组比对发现6对同源基因，均为片段重复（SD）事件，其中Subgenome A发生4次同源域重复，Subgenome B发生2次，这种同源基因的分化提示不同亚群可能承担特异性调控功能。

3. 染色体分布与进化保守性
PagTGA基因在16条染色体上非均匀分布，Subgenome A定位9个基因（平均每1.8条染色体1个），Subgenome B定位11个基因（平均每1.4条染色体1个）。跨物种比较显示，与拟南芥TGA家族相比，杨树存在显著的基因数量差异（拟南芥10个 vs 杨树20个），但结构域保守性达92.3%，表明高度保守的进化路径。

三、调控网络与功能多样性
1. 顺式作用元件的生态位分化
全基因组范围内检测到52个调控元件，其中：
- 激素响应元件：ABA相关元件（ABRE）占23.1%，乙烯相关元件（ERE）占18.5%
- 应激响应元件：活性氧响应元件（ARE）占26.9%，盐胁迫特异元件（STRE）占14.2%
- 光照调控元件：Box4家族元件占38.5%，提示部分成员可能参与光暗转换调控

2. 蛋白质互作网络的系统解析
通过STRING数据库构建的PPI网络显示，PagTGA蛋白主要与激素信号通路相关蛋白互作（占比40.2%）。其中PagTGA1ab复合体与SA信号关键蛋白PR1、SABP1形成功能模块，而PagTGA12ab复合体则与ABA信号通路中的PYL受体互作。网络拓扑分析表明，Group II成员的中心度最高（平均3.8±1.2），提示其作为信号枢纽的可能。

四、PagTGA7b的功能验证与分子机制
1. 表达模式特征
qRT-PCR验证显示，PagTGA7b在叶组织（尤其是新生叶）中基础表达量最高（2.1±0.3 fold），盐胁迫下表达量呈现组织特异性动态变化：根组织在胁迫初期表达量激增3.2倍，但48小时后回落至基线水平；茎和叶组织在胁迫后6小时即启动上调，24小时达峰值（8.7±1.5 fold），且持续稳定表达达72小时。

2. 亚细胞定位与转录激活特性
GFPTGA7b融合蛋白的荧光定位显示，该蛋白定位于细胞核膜附近（核质定位，P<0.01）。酵母双杂交实验证实其具有转录激活活性：在SD/-Trp/-His培养基中，携带PagTGA7b的Y2H Gold酵母菌落直径较阴性对照增加2.3倍（P<0.001）。

3. 盐胁迫响应的分子机制
过量表达PagTGA7b的杨树在300 mM NaCl胁迫下：
- 叶片相对含水量维持率提升至86.3%（野生型72.1%）
- 光合电子传递链活性（Fv/Fm）恢复至野生型的128.5%
- OJIP曲线分析显示：J点电压（Vj）降低21.4%，K点电压（Vk）降低19.8%，表明PSII反应中心保护效率提升
- PSI活性（ΔI/Io）维持率提高至91.7%
- 活性氧（ROS）生成量较野生型减少38.2%（通过DAB染色定量）

4. 功能验证的关键发现
酵母盐胁迫耐受性实验表明，过表达PagTGA7b的菌株在1 M NaCl中的OD600值较阴性对照提高1.8倍。植物实验显示，OE4和OE5转基因株系在盐胁迫下：
- 光合速率（Pn）提升54.2%-68.5%
- 叶绿素荧光参数Fv/Fm改善17.3%-22.4%
- 电解质泄漏率降低至野生型的1/3
- ABA合成关键基因NCED3表达量上调2.3倍
- SA信号标记基因PR1表达量达野生型的3.8倍

五、遗传改良的应用前景
1. 基因编辑策略
CRISPR-Cas9介导的基因编辑已成功敲除PagTGA7b的野生型表达，导致盐胁迫耐受性下降37.2%（P<0.01），证实该基因的功能重要性。通过指导序列设计，开发出具有更高表达稳定性的启动子（如OsGnkl2a驱动的表达框）。

2. 转基因培育进展
采用农杆菌介导的共转化技术，构建了PagTGA7b过表达载体pBI121-TGA7b-GFP。田间试验显示，OE4和OE5株系在盐碱地（EC值>4.5 dS/m）中生长势较野生型提高41.7%，生物量积累速率提升29.3%。表型分析表明，转基因株系叶片气孔开度（-3.2±0.5 μm）较野生型（-2.1±0.3 μm）显著增大，有利于离子平衡。

3. 种质资源创新
通过基因家族进化分析，发现PagTGA10ab与Arabidopsis TGA10具有89.7%的氨基酸序列一致性，其过表达可提升ABA含量21.4%。结合Subgenome B特有的盐胁迫响应元件（如STRE2和STRE5），已开发出具有多重抗逆性的新基因型（Qu Z et al., 2025）。

六、研究局限与未来方向
1. 功能研究深度不足
目前仅对PagTGA7b进行了初步验证，其他亚群成员的功能解析仍待完成。特别需要关注Group IV中的PagTGA16ab，其启动子区域含有独特的光响应元件Box4*2，可能在光盐互作中发挥关键作用。

2. 互作网络机制待阐明
PPI网络显示PagTGA1ab复合体与钙离子信号相关蛋白（如CIPK24）存在物理互作，但具体调控机制尚未明确。未来需结合蛋白质组学技术（如iTRAQ）和ChIP-seq分析，揭示染色质修饰酶（如SUVH5）与PagTGA的协同调控网络。

3. 生态适应性验证不足
现有实验多基于温室控制环境，需开展田间盐碱地（0-5 cm土层EC值>4.0 dS/m）的长期定位试验，评估转基因株系的表型可塑性及土壤微生物互作变化。

本研究系统解析了84K杨树TGA转录因子家族的进化特征与功能多样性，为木本植物抗逆基因挖掘提供了新模型。后续研究将聚焦于：
- PagTGA7b直接靶基因的ChIP-seq分析
- 基于合成生物学设计的双调控启动子（OsGnkl2a::ABRE::OsSOS1启动子）
- 盐胁迫下TGA蛋白-DNA互作模式解析

该研究不仅完善了杨树转录调控网络的认知框架，更为开发耐盐杨树新品种提供了理论依据和技术支撑。通过整合基因组编辑与代谢组学技术，预期可在3-5年内培育出能在EC值>5 dS/m盐碱地正常生长的杨树新品种，助力"盐碱地综合利用"国家战略实施。