非洲猪瘟病毒L11L蛋白通过靶向IRF3和PKR调控抗病毒免疫反应的新机制

《Cellular and Molecular Life Sciences》：African swine fever virus L11L interferes with antiviral responses by targeting the IRF3 and PKR

本研究针对非洲猪瘟病毒（ASFV）免疫逃逸机制不清的关键问题，系统解析了病毒蛋白L11L通过同时靶向干扰素调节因子3（IRF3）和蛋白激酶R（PKR）双重免疫通路的新机制。研究人员发现L11L特异性结合IRF3的S396/S398位点抑制其磷酸化，并阻断PKR的K296介导的二聚化，从而协同抑制I型干扰素通路和宿主翻译关闭。该研究为开发新型ASF减毒活疫苗提供了理论依据和潜在靶点。

　　

在当今全球养猪业面临严峻挑战的背景下，非洲猪瘟（ASF）以其近100%的死亡率持续威胁着生猪产业。这种由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的烈性传染病，自1921年在肯尼亚首次发现以来，已在全球多个国家和地区蔓延。ASFV作为Asfaviridae家族的唯一成员，拥有170-194kb的双链DNA基因组，能在感染的单核细胞和巨噬细胞胞质中复制，产生150-167种病毒蛋白。尽管科学家们已投入大量研究，但有效疫苗的缺失使得ASF的防控依然举步维艰，其中关键瓶颈在于对病毒免疫逃逸机制的认知不足。

病毒与宿主的军备竞赛从未停止。在细胞层面，当病毒入侵时，宿主细胞会启动一系列精密的防御机制。其中，cGAS-STING通路如同细胞的"雷达系统"，能够识别病毒释放的双链DNA，通过合成第二信使2',3'-cGAMP激活STING，进而招募TBK1激酶。被激活的TBK1会使干扰素调节因子3（IRF3）磷酸化，促使IRF3形成二聚体并转入细胞核，启动I型干扰素（IFN-β）的产生，引发抗病毒状态。与此同时，蛋白激酶R（PKR）作为另一道重要防线，能识别病毒双链RNA，通过二聚化自磷酸化，进而磷酸化其底物eIF2α，抑制病毒蛋白合成。这两条通路共同构成了宿主对抗病毒入侵的关键防御体系。

然而，ASFV已进化出多种策略来逃逸这些免疫机制。先前研究发现，ASFV蛋白DP71L、A137R和E120R分别靶向STING、TBK1和IRF3，有效抑制I型干扰素通路。但作为一个编码晚期蛋白的基因，L11L的功能机制尚不明确，尽管研究显示其在病毒毒力中起重要作用。

为揭示L11L的免疫调节功能，韩国忠南大学Jong-Soo Lee团队在《Cellular and Molecular Life Sciences》上发表了最新研究成果。研究人员通过系统的实验设计，结合多种细胞模型和分子生物学技术，深入探索了L11L在ASFV免疫逃逸中的双重作用机制。

研究采用的主要技术方法包括：双荧光素酶报告基因检测系统分析启动子活性，免疫共沉淀和GST pull-down验证蛋白互作，蛋白质印迹分析磷酸化水平，天然PAGE检测二聚化，细胞分级分离和免疫荧光观察核转位，qRT-PCR检测基因表达，siRNA基因敲低技术，以及质谱分析鉴定相互作用蛋白。实验中使用的猪肺泡巨噬细胞（PAMs）等重要样本均注明了具体来源。

L11L靶向IRF3抑制I型干扰素通路

研究人员首先通过双荧光素酶报告基因实验发现，L11L能剂量依赖性地抑制由poly(dA:dT)、cGAS、2',3'-cGAMP、STING、TBK1、IKKε和IRF3诱导的IFN-β启动子活性，但对组成性活性突变体IRF3-5D无抑制作用，提示IRF3可能是L11L的作用靶点。

进一步的机制研究表明，L11L通过其自抑制元件（AIE）结构域（380-427氨基酸）与IRF3直接相互作用。特别值得注意的是，L11L特异性靶向IRF3的S396和S398位点，这两个位点正是TBK1介导IRF3磷酸化的关键位点。

功能实验证实，L11L能有效抑制IRF3的二聚化和核转位。通过天然PAGE和细胞分级实验发现，随着L11L表达量的增加，IRF3二聚体形成和核转位显著减少。

在病毒感染的生理条件下，L11L能显著抑制DNA病毒（如ADV-GFP、HSV-GFP和VACV-GFP）触发的TBK1、IRF3、IκBα、p65和STAT1的磷酸化，同时降低IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-1β、TNF-α等细胞因子以及IFIT1、MCP-1、IFITM3、ISG15、MX-1、OASL等干扰素刺激基因（ISGs）的转录水平，从而创造有利于病毒复制的细胞内环境。

L11L干扰PKR二聚化维持蛋白翻译

通过质谱分析和免疫共沉淀实验，研究团队意外发现L11L还能与PKR直接相互作用。深入的域映射分析表明，L11L特异性结合PKR的N-lobe结构域（270-380氨基酸），其中K296残基对互作至关重要。

竞争实验显示，L11L能剂量依赖性地抑制PKR二聚化，且PKR-K296R突变完全消除了L11L/PKR相互作用。功能上，L11L有效抑制poly(I:C)诱导的PKR自磷酸化（T446）及其底物eIF2α的磷酸化。

嘌呤霉素标记实验证实，L11L能抵抗PKR介导的宿主蛋白翻译关闭，促进病毒蛋白合成，从而增强病毒复制。

L11L的免疫调节功能在ASFV感染中具有生理意义

时间进程实验显示，L11L是一个晚期转录基因，与晚期基因B646L表达模式相似。在ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞中，通过siRNA敲低L11L表达后，IFN和ISGs的转录水平显著上调，证实了L11L在病毒自然感染过程中的免疫抑制功能。

本研究系统阐明了ASFV L11L蛋白通过双重机制逃逸宿主先天免疫的新途径：一方面靶向IRF3的S396/S398位点抑制I型干扰素通路，另一方面通过干扰PKR二聚化维持病毒蛋白翻译。这一发现不仅深化了对ASFV免疫逃逸机制的理解，更重要的是为理性设计减毒活疫苗提供了新靶点。与以往发现的单一靶点病毒蛋白不同，L11L的独特之处在于能同时抑制两条独立的抗病毒通路，这可能部分解释了其在ASFV毒力中的关键作用。鉴于非致病性BA71V毒株缺少L11L基因，且L11L缺失病毒显示减毒表型，针对L11L的疫苗策略有望在安全性和免疫原性间取得良好平衡，为ASF防控开辟新的途径。