TDG蛋白环境将主动DNA去甲基化与染色质及RNA生物学相连接

《Cellular and Molecular Life Sciences》：The TDG protein environment connects active DNA demethylation with chromatin and RNA biology

本研究针对TDG（胸腺嘧啶DNA糖基化酶）在主动DNA去甲基化中的分子机制尚不明确的问题，通过BiolD2邻近标记技术系统绘制了TDG在小鼠胚胎干细胞中的蛋白互作网络。研究发现TDG与染色质重塑因子（RUVBL2、HCFC1）、RNA结合蛋白（PSPC1、NONO）及长链非编码RNA（如Neat1）存在相互作用，并首次证实TDG可识别RNA:DNA杂交体中的氧化5-甲基胞嘧啶（5caC），揭示了其在R-loop调控中的新功能。该研究为解析TDG依赖的主动DNA去甲基化在表观遗传调控网络中的作用提供了新视角。

　　

在生命科学的精密调控网络中，DNA甲基化作为一种关键的表观遗传标记，如同基因的“开关”，控制着细胞的命运。然而，DNA甲基化的动态调节——特别是主动去甲基化过程——如何与染色质结构和基因表达调控相协调，始终是科学家们探索的谜题。胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）是主动DNA去甲基化通路中的核心执行者，它能切除TET双加氧酶氧化5-甲基胞嘧啶（5mC）产生的中间产物5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），从而启动碱基切除修复（BER）过程，恢复未甲基化的胞嘧啶。TDG缺陷会导致小鼠胚胎致死，并伴随组蛋白修饰异常和基因表达紊乱，这强烈暗示TDG的功能远不止于DNA修复，它很可能是一个连接DNA去甲基化、染色质重塑和转录调控的核心节点。为了揭开TDG的“社交网络”，即其蛋白质环境（protein environment），来自巴塞尔大学的研究团队在《Cellular and Molecular Life Sciences》上发表了他们的最新研究成果。

为了系统性地绘制TDG的蛋白互作图谱，研究人员采用了前沿的BiolD2邻近标记技术。该技术通过在TDG上融合一个突变的生物素连接酶（BirA），使其能够对周围约10纳米范围内的蛋白质进行生物素标记，随后通过链霉亲和素亲和纯化和质谱分析，即可鉴定出TDG的邻近蛋白质组。研究首先在人工改造的TDG缺陷型HEK293T细胞中验证了方法的可行性，随后在更为生理相关的小鼠胚胎干细胞（mESC）中进行了深入探究。为了确保结果的可靠性，研究设置了严格的对照，包括仅靶向细胞核的NLS-BirA和靶向染色质的组蛋白H4-BirA*。在mESC中，研究人员还尝试了两种不同的蛋白质提取和纯化策略（变性条件和高盐条件），以最大限度地捕获不同性质的TDG相互作用蛋白。

TDG蛋白环境连接染色质组织与RNA代谢

通过BiolD2-MS分析，研究成功鉴定出47个高置信度的TDG邻近蛋白。基因本体分析显示，这些蛋白主要富集在四个功能模块：染色质组织和转录调控、染色体组织、RNA加工以及核糖体生物发生。这表明TDG处于一个复杂的调控网络中，其功能远超传统的DNA修复。特别值得关注的发现包括：

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  与染色质调节因子的相互作用：TDG与多种染色质调节因子存在邻近关系，如组蛋白H3K4甲基转移酶复合物的关键支架蛋白HCFC1、染色质重塑复合物因子RUVBL1和RUVBL2，以及组蛋白甲基转移酶NSD1。这些发现与之前在TDG缺陷细胞中观察到的组蛋白修饰失衡现象相吻合，提示TDG可能通过影响这些复合物的招募或活性来参与染色质状态的调控。染色质免疫共沉淀测序数据分析进一步证实，TDG与HCFC1、RUVBL1/2等因子在基因组上有显著的共定位。
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  与核斑蛋白（paraspeckle）组分的相互作用：研究意外地发现，TDG与核斑的关键组分PSPC1和NONO存在密切的邻近关系。核斑是一种由长链非编码RNA（lncRNA）Neat1组织的核内无膜细胞器，参与RNA加工和基因调控。这一发现将TDG与RNA介导的核内过程联系起来。

TDG是RNA结合蛋白并与功能型lncRNA相互作用

鉴于TDG与PSPC1和NONO的关联，研究人员推测TDG可能直接与RNA相互作用。通过RNA免疫共沉淀实验，他们证实内源性的TDG确实能够与多种功能型lncRNA结合，包括Neat1、Sra1、Malat1和Kcnq1ot1。进一步的凝胶阻滞实验表明，重组的TDG蛋白能够直接结合体外转录的Neat1和Sra1 RNA，尽管其亲和力低于其经典的DNA底物。这些结果明确地将TDG定义为一种RNA结合蛋白，扩展了其传统的功能认知。

TDG在R-loop结构中具有DNA糖基化酶活性

lncRNA可通过形成RNA:DNA杂交体或R-loop结构（一条RNA链与DNA模板链杂交，同时置换出非模板DNA链）来靶向基因组特定位置。那么，TDG能否作用于这类结构呢？研究人员合成了多种RNA:DNA杂交体和R-loop模型底物，并测试了TDG的酶活性。令人兴奋的是，虽然TDG对RNA链上的碱基没有切割活性，但它能高效地切除DNA链上的5caC和尿嘧啶（U）。动力学分析显示，TDG处理RNA:DNA杂交体中rG·d5caC和rG·dU的初始速率与在双链DNA底物上相当，表明TDG在R-loop背景下仍能有效行使其在主动DNA去甲基化中的核心功能。对公共基因组数据的分析为这一生化发现提供了生理相关性：在mESC中，R-loop在TDG和TET1的结合位点处显著富集。此外，在TDG缺陷的细胞中，部分R-loop区域的染色质可及性发生改变，暗示TDG可能参与调控这些特殊染色质结构的稳定性。

研究结论与展望

本研究通过创新的蛋白质组学方法，首次系统性地描绘了TDG在胚胎干细胞中的蛋白质环境，揭示了其作为连接主动DNA去甲基化、染色质动力学和RNA生物学关键节点的全新角色。主要结论可归纳为：1）TDG与一个复杂的蛋白质网络相互作用，该网络涵盖了染色质修饰/重塑、转录调控和RNA代谢等多个关键细胞过程；2）TDG本身是一种RNA结合蛋白，能够与多种调控性lncRNA（如Neat1）结合；3）TDG能在RNA:DNA杂交体和R-loop结构中对DNA链上的氧化5mC衍生物（5fC/5caC）进行有效的碱基切除，这为理解位点特异性的主动DNA去甲基化提供了新的分子机制。

这些发现具有深远的意义。它们为解释TDG缺陷为何会导致如此严重的多效性表型（如胚胎致死、基因表达紊乱、组蛋白修饰失衡）提供了分子层面的线索：TDG的功能缺失可能同时破坏了DNA甲基化动态、染色质状态以及由lncRNA和R-loop介导的基因调控网络。该研究不仅深化了对表观遗传调控复杂性的理解，也为进一步探索DNA去甲基化在发育、疾病（如癌症可能涉及这些过程的失调）中的作用开辟了新的方向。例如，TDG在R-loop处理中的新功能，可能为理解基因组稳定性维持以及某些神经性疾病提供了新的视角。总之，这项工作将TDG置于一个更广阔的细胞功能网络中，标志着我们对主动DNA去甲基化生物学意义的认识进入了一个新阶段。