农业与工业化学品对人体肠道菌群的体外抗菌活性研究揭示潜在健康风险

《Nature Microbiology》：Industrial and agricultural chemicals exhibit antimicrobial activity against human gut bacteria in vitro

本研究针对工业与农业化学品对人类肠道菌群影响未知的问题，通过体外高通量筛选评估了1,076种污染物对22种常见肠道细菌的生长抑制活性。结果发现168种化学品（主要为杀菌剂和工业化学品）具有此前未报告的抗菌活性，并利用机器学习预测了农药毒性。机制研究表明，污染物胁迫可导致细菌外排泵基因（如acrR）突变，引发对环丙沙星等抗生素的交叉耐药，并影响支链短链脂肪酸等有益代谢物的合成。该研究为化学污染物风险评估提供了新视角，提示需在毒理学评估中纳入肠道菌群考量。

　　

合成化学品已成为现代农业和工业生产中不可或缺的一部分，然而它们的大规模使用和环境持久性导致了污染水平超过地球系统的安全边界。特别令人担忧的是农药污染物，美国食品药品监督管理局和欧洲食品安全局的监测数据显示，食品中残留着数百种不同的农药残留物，同时水体污染问题也日益严重。工业化学品，如全氟和多氟烷基物质（PFASs）、增塑剂、表面涂层和染料，也通过环境污染、农业应用或工业加工途径进入食物链。

令人震惊的是，超过95%的美国人和几乎全部荷兰人群血液中都能检测到PFASs的存在。一项德国母亲队列研究更是发现，血浆中存在数百种来自消费品、化妆品和食品的化学物质，浓度甚至达到微摩尔级别。这些研究表明，人体肠道菌群——一个由数百种微生物物种组成的复杂生态系统——很可能长期暴露于多种化学物质中。然而，目前对农业和工业化学污染物如何影响肠道细菌的了解仍然十分有限。

传统上，农药等化学品通常被定义为具有特定的靶向性（如杀虫剂、除草剂或杀菌剂）。但越来越多的证据表明，许多化学品对非靶标生物也表现出活性，包括土壤细菌和病原体。少数农药和工业化学品已被证明会影响人类和动物肠道菌群。更广泛地说，人类靶向药物也被发现会影响肠道细菌的生长和代谢。这些研究共同表明，许多农药和其他化学污染物可能对肠道细菌具有抑制活性，但目前这些化学品的安全评估并未考虑其对人类肠道微生物组的影响。

由于缺乏系统性的化学暴露定量数据，以及难以将化学品效应与饮食、药物等其他因素区分开来，目前进行化学品对肠道细菌影响的体内评估几乎不可能。因此，研究人员开展了一项大规模体外筛选研究，评估了1,076种化学污染物（包括农药、农药代谢物和工业化学品）对肠道细菌的抗生长效应。

研究人员建立了一个包含1,076种可能通过食物和水进入人体的化合物库，其中包含829种农药（主要是除草剂、杀虫剂和杀菌剂）、119种已知农药代谢物、75种农药相关化合物，以及48种工业化学品和5种霉菌毒素。该化合物库涵盖了英国作物保护协会农药纲要中291个农药类别，以及河流入海农药排放研究中87%的化合物。

研究团队测试了所有这些化合物对22种人类肠道常见细菌菌株生长的影响，这些菌株基于其在健康人肠道微生物组中的丰度和普遍性进行选择，同时考虑了系统发育和代谢代表性。所有菌株在富含营养的mGAM肉汤中厌氧培养，细菌生长通过监测24小时生长曲线并计算曲线下面积（AUC）进行量化。

研究结果令人惊讶：约六分之一的测试化学品（168种）对至少一种细菌菌株具有抑制作用。最敏感的类群是拟杆菌目（Bacteroidales），尤其是狄氏副拟杆菌（Parabacteroides distasonis），而大肠杆菌（Escherichia coli）、动物坏死梭杆菌（Fusobacterium nucleatum subspecies animalis）和阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）则是最不敏感的物种。具有普遍抗肠道细菌活性的化学品类别（至少五分之一化合物有活性）是杀菌剂、工业化学品和杀螨剂。

虽然大多数化合物只对少数菌株有抑制作用，表明其活性谱较窄，但24种化学品显示出广谱毒性，抑制了超过三分之一测试物种的生长。广谱抑制性化合物包括氯生太尔（closantel，一种家畜抗寄生虫药；19个菌株）、四溴双酚A（TBBPA，一种溴化阻燃剂；19个菌株）、十氯酮（chlordecone，一种杀虫剂；17个菌株）、双酚AF（BPAF，用于塑料；12个菌株）、氟啶胺（fluazinam，一种杀菌剂；9个菌株）和埃玛菌素苯甲酸盐（emamectin benzoate，一种杀虫剂；13个菌株）。

约150种化学-细菌相互作用导致了>90%的生长抑制，揭示了33种化合物具有强效的抗肠道细菌活性。独立验证实验表明，大多数主要筛选结果（72%）在不同浓度下仍然可重复。许多化合物在远低于主要筛选测试浓度的条件下就显示出强抑制效应。例如，抑霉唑硫酸盐（imazalil sulfate）、氯生太尔和丙氯灵（prochloraz）在低至2.5μM的浓度下就能抑制直肠真杆菌（Eubacterium rectale）的生长，这是一种产生健康相关代谢物丁酸盐的常见菌种。

研究人员发现，物种对化学污染物的敏感性与其在人类微生物组中的相对丰度呈正相关，但与普遍性无关。对多种化学污染物敏感的菌株也对多种治疗药物敏感，污染物敏感性与人类靶向药物的相关性比与抗生素的相关性更强，这与抗生素具有更广谱活性的特点一致。

为了研究物种水平化学效应如何在细菌群落中转化，研究团队使用了一个包含20种肠道细菌的合成群落（Com20）。该群落系统发育和功能多样，涵盖6个门、11个科和17个属，共同编码了健康人肠道微生物组中超过60%的代谢途径。暴露于BPAF或TBBPA后，群落组成发生了变化，与单培养效应一致，但也观察到一些物种在群落中受到保护。进一步研究发现，这种交叉保护与化合物生物累积有关，大多数BPAF在Com20中被隔离在细胞内。

研究人员通过比较污染物库与先前表征的药物的扩展连通性指纹（ECFPs），发现污染物和药物在化学空间中广泛分散，两组之间分子指纹重叠有限。这表明"农药"或"药物"等标签并不能捕捉抗肠道细菌毒性的分子基础。将污染物和药物库结合使用，显著提高了化学空间的覆盖度。

研究团队利用机器学习方法预测化学品的抗肠道细菌活性。使用两个数据集：本研究中的农药筛选数据和Maier等人的药物筛选数据。对每种化合物，获取了包括分子指纹和基于深度学习的特征嵌入在内的全面结构特征集。随机森林分类器模型通过交叉验证进行训练和评估。仅使用农药训练的模型在预测农药毒性方面表现良好（平均平衡准确度=0.77；平均精确度=0.65）。基于分子描述符特征（排除MoLFormer嵌入）训练的模型性能略有改善，表明这种较小的特征集足以进行预测。

鉴于拟杆菌目对污染物化合物的高敏感性，研究人员旨在研究该目物种中相互作用的机制。他们使用狄氏拟杆菌（Parabacteroides merdae）的混合转座子突变体库来识别调节异生素对细菌适应性影响的基因。该库包含>3,000个非必需基因的条形码转座子插入突变体，能够进行全基因组功能分析。

研究人员进行了针对十种化学品的竞争实验。在≤20μM浓度下测试了TBBPA、BPAF、抑霉唑硫酸盐、氟啶胺、氯生太尔和埃玛菌素苯甲酸盐，而在≥20μM浓度下测试了草甘膦（glyphosate）、丙环唑（propiconazole）、全氟辛酸（PFOA）和全氟壬酸（PFNA）以确保足够的选择压力。

氯生太尔（一种驱虫药）引起了最强的选择，>90%的转座子突变体在编码和启动子区域的不同位置携带插入。该基因编码一个与均匀拟杆菌（Bacteroides uniformis）外排阻遏蛋白acrR同源的转录调节因子，并与tolC和RND外排基因共定位，具有保守的同线性。值得注意的是，acrR转座子突变体也是TBBPA（一种阻燃剂）下的最高命中点，与DMSO对照相比富集了>100倍，但在其他任何污染物下均未富集。

为了进一步表征acrR转座子突变体表型，研究人员分离了在氯生太尔或TBBPA上生长后acrR编码和启动子区域内七个不同位置具有转座子插入的菌株。所有Tn::acrR分离株对两种化学品都表现出抗性，无论它们是在哪种化合物上分离的。当进一步评估两个Tn::acrR菌株时，观察到对氯生太尔的最小抑制浓度（MIC）比野生型菌株增加了八倍。与先前报道的acrR功能丧失与多种细菌中环丙沙星耐药性相关一致，研究人员观察到与野生型相比，对环丙沙星的MIC增加了高达16倍。

不同外排调节因子的富集差异表明化学品外排存在一定特异性，和/或仅靠外排不足以应对其他化学品。然而，一些转运蛋白转座子突变体显示出广泛的污染物敏感性，表明狄氏拟杆菌中存在常见的污染物耐受机制。例如，在疏水化合物转运蛋白fadL家族基因（NQ542_07320和NQ542_08455）中具有插入的菌株在七种异生素中普遍为阴性适应性命中点，而RND多药外排基因座NQ542_06240-50的插入突变体在五种化学品中为显著命中点。其他常见的阴性适应性命中点是编码F₀F₁ ATP synthase复合物组分的基因的转座子突变体，其功能丧失与厌氧条件下对多粘菌素抗生素敏感性增加相关。

为了评估转运蛋白在异生素反应中的参与是否在拟杆菌目中广泛保守，研究人员评估了狄氏拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）的突变体，该菌属于与狄氏拟杆菌不同的科。测试了氯生太尔、TBBPA、PFNA和BPAF对185个转运蛋白插入突变体的精选子集的影响。在编码RND外排泵的BT2687基因的转座子突变体中，观察到在2和10μM氯生太尔下最强的生长减少。该基因是包含共定位基因BT0562和BT0563的基因座的一部分，这些基因编码多药ABC转运蛋白基因。BT2687、BT0562和BT0563的功能丧失转座子突变体先前已被链接到狄氏拟杆菌中对抗生素和杀菌剂的敏感性增加。

暴露于250和100μM PFNA抑制了在BT3337和BT3338具有插入的转座子突变体，这些基因编码生物膜形成所需的RND外排泵，以及对夫西地酸、氯丙嗪和硫利达嗪的耐受性。BT3337和BT3338在狄氏拟杆菌中的最高同源性和同线性匹配是RND编码基因座NQ542_09525-35，这是在混合筛选中PFNA的特异性阴性适应性命中点。

狄氏拟杆菌转座子条形码测序插入突变体基因命中点显示，在大多数测试化合物（七种）中，各种京都基因与基因组百科全书（KEGG）代谢途径富集。在20μM TBBPA选择下，映射在支链氨基酸（BCAA）降解途径中的转座子突变体显著富集。TBBPA下阳性选择的第二个最高基因座是porA分解代谢基因簇，包含四个具有>30倍富集的转座子插入基因。该途径参与将BCAAs降解为支链短链脂肪酸。

在500μM PFNA挑战下，次级代谢基因NQ542_07535-55的功能丧失转座子插入突变体被阳性选择（约16倍富集），但在20μM TBBPA下是阴性适应性命中点。这些基因通过同源性被识别为推定的肌醇脂质生物合成基因簇的一部分。该基因簇在拟杆菌门中广泛存在，肌醇脂质生产的丧失与细胞荚膜变化和对抗菌肽的抗性增加相关。

为了验证表型，研究人员分离了两个狄氏拟杆菌突变体（在基因NQ542_07540的两个位置具有转座子插入，该基因编码推定的磷脂酰肌醇磷酸磷酸酶），这些菌株在500μM PFNA上富集后获得。这些菌株在一系列浓度下对PFNA表现出抗性增加和对TBBPA的超敏感性，与混合适应性一致。评估PFNA生物累积发现没有生长依赖性差异，表明肌醇脂质代谢在PFNA抗性中具有累积非依赖性功能。

本研究揭示了168种关注化学品与常见人类肠道细菌之间的588种抑制性相互作用，其中大多数化学品此前未被报道具有抗菌特性。杀菌剂和工业化学品显示出最大影响，约30%表现出抗肠道细菌活性。研究结果表明，化学污染物对人类肠道菌群的抗菌活性应在未来关于微生物组和抗菌素耐药性出现的研究中予以考虑，同时也应纳入毒理学评估。

化学污染物抑制活性的普遍性，连同人类靶向药物的活性，挑战了将化学品分类为抗生素、人类靶向药物、工业化学品和农药的传统分类法。许多异生素的抗菌活性目前未在其潜在不利影响评估中考虑，毒性研究通常以与捕捉肠道微生物组效应不兼容的方式设置。

针对非模型但普遍存在的肠道细菌的遗传筛选提供了关于细菌如何在化学胁迫下维持适应性的机制见解，并指出了潜在的分子靶点。研究人员观察到化合物依赖性依赖于特定外排调节因子以在污染物存在下生存。外排泵的调节是狄氏拟杆菌和狄氏拟杆菌之间保守的机制，跨越不同的拟杆菌目科。这种显著保守性，连同先前来自大肠杆菌遗传筛选的观察结果，强化了外排作为一般化学防御机制的关键作用。

狄氏拟杆菌中的遗传选择富集了分解代谢和生物合成基因，表明代谢在响应异生素胁迫中起着基本作用。这种富集让人联想到在大肠杆菌非抗生素药物筛集中观察到的代谢相关基因命中点的普遍性。在几种异生素下，涉及产生对人类健康具有已知影响的次级代谢物的酶的功能丧失提供了生长优势。这提出了暴露于化学污染物可能影响肠道中选择景观的可能性，导致微生物组-宿主相互作用途径中的代谢改变。

研究中使用的主要技术方法包括：大规模体外高通量生长抑制筛选，使用自动化工作站和微孔板读板器监测22种肠道细菌对1,076种化学品的生长反应；化学遗传学筛选，利用转座子突变体库（TnBarSeq）在全基因组范围内鉴定介导污染物耐受性的细菌基因；合成微生物群落（Com20）实验，评估污染物在复杂群落环境中的效应；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，定量化学品在培养物中的生物累积；机器学习建模，使用随机森林分类器基于化学结构特征预测物种特异性毒性；以及物理基于毒代动力学（PBTK）模型，用于体外到体内外推（IVIVE）以评估人体相关暴露剂量。

研究结果表明，化学污染物对人类肠道菌群具有广泛且此前未被充分认识的抑制作用，这种作用可能通过影响细菌适应性、选择耐药突变和改变代谢输出而对人体健康产生潜在影响。该研究为理解化学污染物与肠道微生物组之间的相互作用提供了重要见解，强调了在未来化学安全评估和微生物组研究中考虑这些效应的必要性。