RND多药外排泵系统构象可塑性揭示抗生素耐药性进化新机制

《Nature Communications》：Conformational plasticity across phylogenetic clusters of RND multidrug efflux pumps and its impact on substrate specificity

本研究针对革兰氏阴性菌中RND多药外排泵系统介导的抗生素耐药性机制，通过系统发育分析和冷冻电镜技术，揭示了AcrB和OqxB代表的两个系统发育簇在构象状态平衡和底物识别中的关键差异。研究发现单个保守残基V612F的替换不仅改变底物结合口袋的理化性质，更通过调控转运循环中构象状态平衡，重塑耐药表型。该工作发表于Nature Communications，为理解RND外排泵的进化分化和耐药性调控提供了结构基础。

　　

在抗生素与细菌的军备竞赛中，革兰氏阴性菌通过耐药结节化细胞分裂（Resistance Nodulation and Cell Division, RND）超家族多药外排泵构建了强大的防御系统。这些跨越细胞膜的三部分外排系统（由内膜泵、周质适配蛋白和外膜通道组成）能够将结构各异的抗生素排出胞外，导致临床多重耐药性的产生。尽管大肠杆菌AcrB作为RND泵的典型代表已被广泛研究，但其同源蛋白在不同病原体中表现出的底物特异性差异机制仍不明朗。尤其令人困惑的是，为何亲缘关系相近的外排泵对红霉素等大分子药物的转运效率存在显著差异？这一科学问题的解答对于开发新型抗生素增效剂具有重要意义。

德国法兰克福大学Klaas M. Pos团队联合国际科研力量，在《Nature Communications》发表了关于RND多药外排泵构象可塑性及其对底物特异性影响的重要研究。研究人员通过系统发育分析将RND泵划分为AcrB和OqxB两个主要簇，发现单个保守残基的替换（AcrB V612F）即可模拟OqxB簇的耐药特征。这项研究首次通过冷冻电镜揭示了不同RND泵在天然状态下存在的构象差异，并证明这种构象可塑性是调控底物特异性的关键因素。

研究主要运用了系统发育分析确定RND泵的进化关系，通过点突变构建AcrB变异体并进行表型筛选（包括平板稀释实验和最小抑菌浓度测定），利用X射线晶体学解析底物结合复合物结构，采用冷冻电镜（cryo-EM）分析不同状态下的构象分布，结合分子对接和分子动力学模拟探讨底物结合模式，并使用纳米盘重建技术模拟近生理环境。

系统发育聚类揭示保守的底物结合口袋残基

研究人员首先对代表性革兰氏阴性菌的RND蛋白进行系统发育分析，发现AcrB和OqxB两个主要簇具有高度保守的深结合口袋（Deep Binding Pocket, DBP）残基。值得注意的是，AcrB簇中的V612位点在OqxB簇中被苯丙氨酸（F）取代。这一自然变异在进化研究中被证实能够改变耐药谱，提示该位点在功能分化中的关键作用。

保守DBP替换改变AcrB耐药表型

通过构建AcrB V612系列突变体（V612F/V612W/V612N/V612A），研究人员发现V612F变异显著提高了对苯酚类（氯霉素）和利奈唑胺的耐药性，同时降低了对大多数其他底物（特别是红霉素）的抵抗力。全细胞转运实验进一步证实V612变异体的berberine外排效率降低，其中V612F表型最接近OqxB簇的特征。

V612F/W与米诺环素的TTT状态结构解析

晶体结构显示AcrB V612F/W变异体与米诺环素结合时呈现对称的TTT构象，而异构的野生型AcrB通常为LTO状态。结构分析表明，引入的芳香族侧链（F/W612）与F615、F610形成π-π堆叠，缩小了DBP的沟槽尺寸，导致米诺环素结合位点发生偏移但通过建立新的氢键网络维持结合稳定性。

去污剂促使AcrB向T状态平衡转变

冷冻电镜分析揭示去污剂DDM通过结合在TM1/TM2沟槽中稳定T状态，显著改变AcrB构象平衡。在纳米盘重建的近生理环境中，野生型AcrB存在多种构象状态（LTO/LLL等），而V612F变异体则显著偏向T状态（53.1%），证明该替换通过稳定DBP开放构象影响状态平衡。

肺炎克雷伯菌OqxB的冷冻电镜结构

对OqxB簇代表蛋白OqxB的结构解析发现，其在天然状态下呈现独特的OOO*对称构象，所有底物通道均处于关闭状态。与AcrB的动态构象选择机制不同，OqxB可能采用诱导契合机制，其狭窄的结合口袋和通道结构可能限制大分子底物的进入。

研究结论与讨论

本研究首次实验证实了RND外排泵存在两种不同的底物识别机制：AcrB代表的构象选择机制（存在预形成的结合口袋）和OqxB代表的诱导契合机制（底物诱导构象变化）。这种机制差异与系统发育聚类相关，且单个残基替换即可通过改变构象平衡来重塑底物特异性。该发现不仅解释了同源外排泵底物谱差异的结构基础，更为针对特定病原体开发精准抗生素增效剂提供了新思路。

值得注意的是，OqxB的O*状态可能代表转运循环中的中间态，其与周质适配蛋白的相互作用可能调控状态转换。未来对完整三部分系统的结构研究将进一步揭示RND泵的工作机制。这项研究通过整合系统发育学、结构生物学和计算生物学，为理解多药外排泵的分子进化与功能调控建立了新范式。