靶向PCBP2生物分子凝聚物的小分子抑制为阿尔茨海默病提供治疗新策略

《Nature Communications》：Pharmacologic inhibition of PCBP2 biomolecular condensates relieves Alzheimer’s disease

本研究针对阿尔茨海默病(AD)中生物分子凝聚物的病理作用，发现PCBP2蛋白通过液-液相分离(LLPS)形成凝聚物，进而招募线粒体蛋白和RNA结合蛋白，导致线粒体功能障碍和BACE1 mRNA稳定性增加。研究人员通过小分子筛选鉴定出CN-0928，该化合物通过结合INTS1下调PCBP2表达，有效缓解AD病理特征和认知衰退。这项发表于《Nature Communications》的工作揭示了生物分子凝聚物在AD中的新机制，为治疗提供了新靶点。

　　

在阿尔茨海默病的研究领域，细胞外淀粉样蛋白沉积和细胞内Tau蛋白聚集长期以来被视为两大病理标志。然而，针对这些病理特征的临床治疗尝试屡屡受挫，促使科学家们将目光转向更基础的细胞生物学过程。近年来，生物分子凝聚物这一概念逐渐崭露头角——这些无膜包裹的细胞器通过液-液相分离形成，能够富集特定蛋白质和核酸分子，在细胞功能调控中发挥关键作用。特别是在神经退行性疾病中，应激颗粒等生物分子凝聚物的异常形成与疾病进展密切相关，但它们在阿尔茨海默病中的具体作用和机制仍不清楚。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，由重庆医科大学附属第一医院陈国俊教授领导的研究团队发现，多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)在AD患者和模型动物脑组织中表达升高，并通过液-液相分离形成生物分子凝聚物。这些凝聚物如同"分子陷阱"，大量捕获线粒体蛋白和mRNA结合蛋白，导致线粒体形态和功能受损，同时通过影响BACE1 mRNA的降解促进淀粉样蛋白生成。

为了验证PCBP2凝聚物的形成机制，研究团队运用了多种关键技术：包括荧光激活颗粒分选(FAPS)结合质谱分析鉴定凝聚物组成成分；体外重组蛋白液-液相分离实验；荧光恢复后漂白(FRAP)技术分析凝聚物动态特性；小分子化合物筛选平台；以及化学蛋白质组学靶点鉴定。研究中使用了AD患者脑组织样本、5xFAD和APP/PS1转基因小鼠模型，以及SH-SY5Y细胞系等实验材料。

PCBP2 condensates are associated with elevated PCBP2 protein levels in AD

研究发现，在AD患者颞叶皮层中，PCBP2蛋白水平显著高于年龄匹配的对照组，同时APP蛋白也相应升高。PCBP2凝聚物在AD患者神经元胞质中数量增多、体积增大，呈现不规则形状。在5xFAD和APP/PS1小鼠模型的大脑皮层和海马区也观察到类似现象。细胞实验中，SH-SY5Y细胞过表达APP或经砷酸盐(应激颗粒诱导剂)处理后，PCBP2形成明显的胞质凝聚物。重要的是，PCBP2凝聚物具有动态特性，能够发生融合，并可被1,6-己二醇(1,6-HD)溶解。

PCBP2 undergoes LLPS

通过体外实验证实，纯化的全长PCBP2在含10% PEG的缓冲液中能形成液滴状结构，且这些液滴能够发生融合。FRAP实验显示，光漂白区域的荧光信号在120秒内恢复。在生理相关浓度下(2μM PCBP2与20 ng/μL RNA)，PCBP2可在体外形成液-液相分离凝聚物。细胞实验中，转染mCherry-PCBP2的SH-SY5Y细胞在48小时后形成明显的凝聚物，FRAP显示荧光在60秒内恢复，进一步支持了PCBP2通过LLPS形成凝聚物的观点。

PCBP2 condensates recruited mitochondrial and RNA-binding proteins

通过荧光激活颗粒分选技术分离PCBP2凝聚物并进行蛋白质组学分析，发现1209种蛋白质在凝聚物中富集。这些蛋白质部分与处理小体(P-body)和应激颗粒成分重叠，包含大量RNA结合蛋白(如3'UTR结合蛋白、无义介导的mRNA降解通路蛋白等)。令人惊讶的是，140种线粒体成分也显著富集，包括呼吸链复合物、ATP合成蛋白和转位酶等。基因本体分析还揭示了与突触信号和Aβ反应相关的蛋白质。免疫荧光证实线粒体蛋白TOM20等与PCBP2凝聚物共定位。体外实验表明，TOM20本身不能形成液滴，但与PCBP2共同孵育时可被招募入凝聚物。

Disrupted mitochondrial morphology and function

基因集富集分析(GSEA)证实线粒体蛋白在PCBP2凝聚物中显著富集。表达mCherry-PCBP2的SH-SY5Y细胞显示线粒体形态异常，面积、周长、长宽比和形态因子等参数均发生改变。透射电镜观察到线粒体嵴减少或缺失。功能上，PCBP2凝聚物导致活性氧(ROS)水平升高，氧消耗速率和ATP水平下降，糖酵解能力减弱。在SH-SY5Y-APP细胞中，PCBP2与颗粒状TOM20的共定位增强，而敲低PCBP2可降低ROS水平。

Impaired BACE1 3'UTR degradation relative to amyloid deposition

RNA测序显示，敲低PCBP2导致416个差异表达基因，其中BACE1 mRNA显著下调。蛋白水平上，PCBP2敲低降低BACE1及其切割产物CTFs，而过表达则产生相反效果。PCBP2调控BACE1 mRNA稳定性，延长其半衰期。RNA pulldown和MS2-Trap实验证实PCBP2特异性结合BACE1的3'UTR而非5'UTR。进一步机制研究发现，PCBP2凝聚物通过 sequestration NMD机制关键蛋白UPF1，减少其在凝聚物外的分布，从而抑制BACE1 mRNA降解。删除PCBP2的内在无序区域(IDR3)破坏凝聚物形成，并降低BACE1蛋白水平。

Small-molecule CN-0928 reduced condensates and alleviated AD

通过表型筛选发现小分子CN-0928能降低PCBP2蛋白水平，而不影响APP或ADAM10。CN-0928(1-2μM)有效减少PCBP2凝聚物，降低BACE1、CTFs和Aβ_40/42水平，改善线粒体形态。在5xFAD小鼠中，腹腔注射CN-0928降低脑内PCBP2和BACE1蛋白，减少PCBP2凝聚物和Aβ沉积，并改善 Morris水迷宫测试中的认知功能。

CN-0928 downregulated PCBP2 protein by INTS1

化学蛋白质组学鉴定出INTS1为CN-0928的作用靶点。敲低INTS1而非其他候选蛋白可介导CN-0928对PCBP2的调控作用。机制上，CN-0928与INTS1的Arg-1404结合，调控PCBP2转录和蛋白水平。

本研究首次揭示了PCBP2生物分子凝聚物在AD中的关键作用，通过同时影响线粒体功能和淀粉样蛋白生成两条通路，整合了AD病理中看似独立的重要途径。鉴定出的小分子CN-0928通过靶向INTS1下调PCBP2表达，为治疗AD提供了新的策略。这项工作不仅深化了对生物分子凝聚物在神经退行性疾病中作用的理解，也为开发针对相分离异常疾病的治疗方法奠定了坚实基础。