亚甲蓝治疗致命性脑型疟疾及血液生物标志物的发现：基于食蟹猴模型的多组学研究

《Nature Communications》：Methylene blue treatment of fatal cerebral malaria and identification of potential blood biomarkers

本研究针对脑型疟疾(CM)诊断困难和高死亡率的问题，通过Plasmodium coatneyi感染的食蟹猴模型，探讨亚甲蓝(MB)的治疗机制并筛选血液生物标志物。研究发现MB可逆转脑干转录组异常，鉴定出S100A9、MAG等9个与中性粒细胞相关的生物标志物，为CM的快速诊断和新疗法开发提供重要依据。

　　

在热带地区的医疗前线，脑型疟疾(CM)始终是悬在医生和患者头上的达摩克利斯之剑。这种由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)感染引发的严重并发症，即便在规范使用青蒿琥酯治疗的情况下，非洲儿童死亡率仍高达8.5%，更有四分之一幸存者会遭受终身神经功能损伤。随着青蒿素耐药性在非洲的蔓延，开发新的治疗策略和诊断工具显得尤为紧迫。

传统诊断依赖临床症状判断，往往错过最佳治疗时机。而脑型疟疾发病机制复杂，涉及感染红细胞在脑微血管的滞留、血脑屏障(BBB)破坏以及神经炎症级联反应等多个环节，其中中性粒细胞等免疫细胞的作用尚不明确。更棘手的是，由于伦理限制，很难在儿童患者中进行深入的病理机制研究。

为此，新加坡国立大学Benoit Malleret团队选择Plasmodium coatneyi感染的食蟹猴(Macaca mulatta)作为人类脑型疟疾的理想模型。这种非人灵长类模型与人类感染具有高度相似性：均为三日疟原虫，感染红细胞表面存在 knob 样结构介导细胞黏附，晚期原虫在脑微血管滞留，并能出现类似的神经系统症状。研究团队设计精细的实验方案，将18只雄性食蟹猴分为五组：未感染对照组、感染未治疗组以及三个不同剂量MB治疗组(6mg/kg、10mg/kg、17mg/kg)，通过系统的病理学和转录组学分析，深入探索MB的治疗机制并筛选潜在的诊断生物标志物。

主要技术方法包括：建立P. coatneyi感染的食蟹猴脑型疟疾模型；进行组织病理学评估(H&E染色)；利用RNA-seq技术对脑干、丘脑、小脑、心脏、肾脏和肝脏进行全转录组分析；通过IPA (Ingenuity Pathway Analysis)进行通路富集分析；结合公共数据库(GSE116306、GSE103259)进行跨物种比较转录组学验证；使用CIBERSORT进行免疫细胞浸润分析。

组织特异性基因表达模式

研究人员首先通过层次聚类和主成分分析(PCA)探究不同组织的基因表达特征。脑组织(脑干、丘脑和小脑)明显聚集在一起，与心脏、肝脏和肾脏样本区分开来。在脑组织中，感染未治疗组(Pcoat⁺ MB^-)的基因表达谱发生显著改变，而MB治疗组(Pcoat⁺ MB⁺)与未感染对照组(Pcoat^- MB^-)高度重叠，这种模式在脑干中最为明显。这表明P. coatneyi感染对脑干转录组的影响最为显著，而MB治疗能够有效逆转这种改变。

亚甲蓝缓解脑部病理损伤

组织学分析为转录组发现提供了有力支持。未治疗组脑组织中出现大量含疟色素的红细胞聚集，大脑血管周围间隙扩张，小脑浦肯野细胞变性坏死。相比之下，MB治疗组疟色素沉积显著减少，出血减轻，仅残留少量含铁血黄素巨噬细胞。值得注意的是，尽管MB有效缓解了脑部病理改变，但对轴索或神经元损伤、肾脏损伤、肝脏损伤和血管炎的改善效果有限，提示MB对脑型疟疾的治疗作用具有组织特异性。

脑干差异表达基因的逆转

差异表达基因(DEG)分析显示，P. coatneyi感染在脑干中诱导了801个DEG，远多于小脑(493个)和丘脑(173个)。更重要的是，MB治疗成功逆转了其中574个基因(72%)的表达水平，使其恢复至基线状态。这些基因主要富集于粒细胞粘附渗出、IL-10信号通路、补体系统、急性期反应等炎症相关通路。

神经炎症信号通路的核心作用

通路分析揭示了一个关键发现：神经炎症信号通路是连接急性期反应和粒细胞渗出两大病理过程的核心枢纽。该通路中的多个关键分子如MMP9、TNF-α、IL-1β均与血脑屏障破坏密切相关。同时，促进神经元存活的转录因子CREB在感染期间显著下调，而MB治疗可恢复其表达水平。β-分泌酶和NADPH氧化酶(NOX)等导致神经元损伤的因子也受到MB的调控，从分子层面解释了MB的神经保护机制。

跨物种生物标志物筛选

研究团队创新性地将食蟹猴脑干转录组数据与两个公共数据库进行整合：P. coatneyi感染食蟹猴血液RNA-seq数据集和P. falciparum感染人类血液微阵列数据集。通过三重验证，最终筛选出9个与脑型疟疾严重程度相关的核心生物标志物：MAG、IL1RN、LCN2、S100A8、CD177、S100A9、CHIT1、MMP9和NFE2。

这9个生物标志物在区分脑型疟疾患者方面表现出卓越性能。正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型显示，它们能够准确区分感染与未感染、治疗与未治疗样本，预测能力显著优于随机模型。与已发表的脑型疟疾基因特征相比，新标志物在食蟹猴脑干样本分类中达到100%准确率(AUC=1.00)。在人类患者验证中，脑型疟疾组的meta评分显著高于健康对照、轻度疟疾和非脑型严重贫血患者，且在西尼罗病毒性脑炎患者中表达水平相对较低，显示出良好的特异性。

中性粒细胞的关键角色

免疫细胞分析揭示了一个重要现象：9个生物标志物中除MAG和NFE2外，其余7个均主要在中性粒细胞中高表达。CIBERSORT分析显示，感染未治疗组脑干中中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞等免疫细胞有增多趋势，特别是活化肥大细胞显著增加。这提示中性粒细胞不仅是脑型疟疾免疫反应的重要参与者，还可能直接参与疾病的发生发展过程。

治疗时间窗的重要性

值得注意的是，尽管高剂量MB组(10mg/kg和17mg/kg)在外周血寄生虫清除方面效果更好，但部分动物仍出现临床恶化。这可能与治疗时机有关：脑型疟疾进展迅速，高剂量组治疗启动较晚，错过了最佳治疗时间窗。研究表明，早期给予较低剂量MB可能比延迟的高剂量治疗更有效，强调了治疗时机在脑型疟疾管理中的关键意义。

本研究通过整合非人灵长类动物模型、多组学分析和跨物种验证，首次系统阐明了亚甲蓝治疗脑型疟疾的分子机制，并鉴定出一组具有诊断价值的中性粒细胞相关血液生物标志物。这些发现不仅为理解脑型疟疾发病机制提供了新视角，也为开发快速诊断工具和新型治疗策略奠定了坚实基础。特别是在青蒿素耐药形势日益严峻的背景下，亚甲蓝作为一种能穿透血脑屏障的多靶点药物，展现出重要的临床转化潜力。

未来研究需要进一步验证这些生物标志物在预测和预后方面的价值，并探索其在监测新疗法效果中的应用。同时，阐明中性粒细胞在脑型疟疾中的具体作用机制，将有助于开发更精准的免疫干预策略。这项发表于《Nature Communications》的工作为攻克脑型疟疾这一重大全球健康问题迈出了关键一步。