赖氨酸甲基化介导的SMYD2降解通过casticin作用使非小细胞肺癌细胞对奥西美替尼治疗产生敏感性

《Biochemical Pharmacology》：Lysine methylation-mediated SMYD2 degradation by casticin sensitizes non-small-cell lung cancer cells to osimertinib therapy

EGFR-TKI耐药机制研究：Casticin通过靶向SMYD2增强NSCLC治疗敏感性

　　

潘凯凌|徐波|娄阳|薛建波|金学航|党明珠|潘思远|黄赞|陈仙国

中国心胸外科部门

摘要

针对表皮生长因子受体（EGFR）的酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的应用显著改善了非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗效果。然而，原发性和获得性耐药性限制了EGFR-TKIs的疗效，这些机制仍需进一步阐明。在本研究中，我们发现Casticin在体外和体内实验中有效抑制了EGFR突变型和RAS突变型的肺癌细胞，并通过靶向SMYD2增强了细胞对EGFR-TKIs的敏感性。其机制在于Casticin与SMYD2结合，抑制了SMYD2的活性，并通过减少SMYD2与KDM5B的相互作用促进了SMYD2的K80位点甲基化，进而通过STUB1介导的泛素化作用增强了SMYD2的降解。SMYD2和KDM5B的过表达会抵消Casticin的细胞毒性作用。在体外和体内实验中，敲低或抑制SMYD2均可提高细胞对EGFR-TKIs的敏感性。综上所述，Casticin能够抑制非小细胞肺癌细胞并对EGFR-TKIs产生敏感性，有望作为增强剂来提高其治疗效果。

引言

肺癌是全球诊断最多的癌症之一，也是癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例的85% [1]。发现表皮生长因子受体（EGFR）基因突变是NSCLC进展的关键驱动因素，这为治疗手段的发展带来了重大进展。一系列EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs），如吉非替尼（Gefitinib）和奥西美替尼（Osimertinib），已被开发用于NSCLC的治疗 [2]。然而，原发性和获得性耐药性限制了这些药物的长期疗效 [3]。深入研究克服EGFR-TKIs耐药性的机制对于改进NSCLC的治疗至关重要。

天然产物长期以来一直被认为是改善靶向治疗的宝贵资源。例如，小檗碱与奥西美替尼的组合可选择性降低MET扩增且对奥西美替尼耐药的NSCLC细胞的存活率 [4]。同样，黄芩（Scutellaria baicalensis）的根提取物通过抑制STAT3诱导了EGFR-TKIs耐药细胞的凋亡 [5]。最近，从木槿（Hibiscus syriacus）中提取的Casticin（又称vitexicarpin）被证明具有多种功能，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤、镇痛和调节内分泌作用 [6,7]。Casticin在多种癌症类型中表现出抗增殖和促凋亡的特性，包括膀胱癌 [8]、乳腺癌 [9]、口腔癌 [10]、结肠癌 [11] 和肺癌 [12]。Casticin通过促进miR-338-3p的表达来抑制急性髓系白血病 [13]。此外，Casticin还作为拓扑异构酶IIa的抑制剂，诱导DNA双链断裂并促进癌细胞的凋亡 [12]。然而，目前尚未有研究探讨Casticin对肺癌细胞耐药性的影响，其作用靶点也尚未明确。

SMYD2（Suppressor of variegation, Enhancer of Zeste, Trithorax）是一种活性赖氨酸甲基转移酶，通过甲基化和激活关键的组蛋白和非组蛋白底物来促进癌症进展。SMYD2通过甲基化组蛋白H3的第4位和第36位赖氨酸（H3K4和H3K36）来增强基因转录并促进肿瘤发生 [14]。它还甲基化并抑制肿瘤抑制基因（如P53和PTEN）的活性 [15,16]。此外，SMYD2在DNA损伤时还会甲基化XRCC6（X射线修复交叉互补蛋白6） [17]。有趣的是，这些SMYD2的下游靶点已被证实与EGFR-TKIs的耐药性有关 [18, [19], [20], [21]]。事实上，SMYD2的抑制作用与多种抗癌药物（包括顺铂、多柔比星、5-氟尿嘧啶和阿霉素）具有协同效应，主要通过抑制P-糖蛋白实现 [22]。在结直肠癌中，靶向SMYD2可通过抑制血管生成来增强阿帕替尼（Apatinib）的治疗效果 [23]。在顺铂耐药的肺腺癌细胞和大细胞肺癌细胞中观察到SMYD2的过表达，其抑制作用可逆转顺铂耐药性 [24,25]。一项全基因组关联研究显示，携带SMYD2等位基因的个体在接受一线铂类药物治疗的晚期NSCLC患者中预后较差 [26]。尽管SMYD2是一个有前景且有效的抗肿瘤靶点，但如何干预其活性仍有待研究。

在本研究中，我们发现Casticin对EGFR突变型和RAS突变型的NSCLC细胞具有抑制作用。此外，Casticin与EGFR-TKIs联合使用表现出协同效应，对已经产生EGFR-TKIs耐药性的细胞具有显著的抑制效果。Casticin通过靶向SMYD2并干扰SMYD2与KDM5B（赖氨酸去甲基化酶5B）的相互作用来实现这一效果，从而促进SMYD2在K80位点的甲基化，并通过STUB1（STIP1同源物和U-box结构域蛋白1）介导的泛素化促进其降解。我们的研究揭示了SMYD2在EGFR-TKIs耐药性中的潜在机制，表明Casticin可作为NSCLC靶向治疗的增敏剂。

实验部分

细胞培养

人类非转化肺上皮细胞（Beas-2B，RRID:CVCL_0168）、人类肺腺癌KRAS突变细胞（A549，RRID:CVCL_0023；H157，RRID:CVCL_0463和Calu-1，RRID:CVCL_0608）、NRAS突变细胞（H1299，RRID:CVCL_0060）、EML4-ALK融合细胞（H2228，RRID:CVCL_1543）以及EGFR突变细胞（PC9，RRID:CVCL_B260；HCC827，RRID:CVCL_2063和H1975，RRID:CVCL_1511）、人类肺鳞状癌细胞（H520，RRID:CVCL_1566；SK-MES-1，RRID:CVCL_0630；H226，RRID:CVCL_1544）

使用小干扰RNA转染细胞

阴性对照（si-NC）、针对STUB1（si-STUB1）和KDMs（si-KDMs）的siRNA由Riobio（中国广州）合成。使用riobFECTTM CP试剂（Riobio，中国广州）在24孔板中对细胞进行转染，每种siRNA的最终浓度为50 nM，具体操作按照厂家说明书进行。各siRNA的序列如下：

STUB1 5′-CTG TGA AGG CGC ACT TCT T-3′

KDM1A 5′-GCT CGA CAG TTA CAA AGT T-3′

KDM1B 5′-GCA ACT GCA TAA CTT TGG A-3′

KDM2A 5′-GCA AGC AGA TCA CTC GAA A-3′

Casticin对肺癌细胞的抑制作用

评估了Casticin对人类非转化上皮细胞和转化肺癌细胞的抑制效果。结果表明，非转化上皮细胞Beas-2B对Casticin治疗相对不敏感。Casticin对EGFR突变型NSCLC细胞（PC9、HCC827和H1975）、RAS突变型NSCLC细胞（H1299和H157）以及H226细胞具有显著的抑制作用，而其他肺癌细胞对Casticin相对不敏感（图1A）。这些结果提示...

讨论

迫切需要新的治疗策略来克服EGFR-TKIs的耐药性。本研究显示，Casticin与EGFR-TKIs联合使用具有协同效应，提高了NSCLC细胞对EGFR-TKIs的敏感性。Casticin与SMYD2结合，减少了SMYD2与KDM5B的相互作用，从而增强了SMYD2的甲基化。SMYD2甲基化的增强通过STUB1介导的泛素化促进了其降解。我们的工作为...

作者贡献声明

潘凯凌：撰写初稿、进行研究、获取资金、数据管理。徐波：进行研究。娄阳：数据可视化。薛建波：数据可视化。金学航：数据验证。党明珠：数据验证。潘思远：数据验证。黄赞：撰写、审稿和编辑。陈仙国：撰写、审稿和监督。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

贡献

KP和BX负责实验操作。YL和JX负责数据图表的制作、手稿的撰写和修改。ZH和XC提供了实验方法指导、数据解读以及技术和材料支持。XJ、MD和SP负责数据收集、分析、解读，并协助进行细胞实验。KP和ZH负责项目设计、监督，并进一步修改了手稿。所有作者共同审阅并批准了最终版本的手稿。