基于网络药理学的策略，用于探究欧洲山茱萸（Eucommia ulmoides Oliv.）治疗免疫失调的分子机制

《Chinese Journal of Analytical Chemistry》：Network pharmacology-based strategy to explore the molecular mechanisms of Eucommia ulmoides Oliv. for treating immune dysregulation

本研究基于网络药理学策略，系统解析 Eucommia ulmoides (EUO) 治疗免疫失调（ID）的分子机制。通过多数据库筛选获得EUO的114种活性成分及353个潜在靶点，与ID相关的850个靶点存在110个重叠靶点。PPI网络分析显示TP53、AKT1、IL6和TNF为关键靶点，富集分析揭示“脂质与动脉粥样硬化”通路为核心。分子对接证实槲皮素、山柰酚和β-胡萝卜素与上述靶点结合亲和力较高，MD模拟进一步验证了复合物的动态稳定性。研究结果为EUO开发为安全有效的免疫调节剂提供了理论依据。

　　
Eucommia ulmoides (EUO), a traditional Chinese medicinal herb, has been extensively studied for its immunomodulatory properties. This study integrates network pharmacology and computational biology approaches to systematically elucidate the molecular mechanisms underlying EUO's therapeutic potential in immune dysregulation (ID). The research employs a multi-step strategy to identify key active ingredients, their interaction targets, and critical pathways mediating the treatment of ID. The following sections provide a comprehensive analysis of the findings.

### 1. Research Context and Objectives
Immune dysregulation (ID) represents a complex pathological state characterized by imbalanced immune responses, leading to autoimmune disorders, allergic reactions, and chronic infections. Current Western therapies, while effective, often suffer from severe side effects such as osteoporosis and increased infection susceptibility. Traditional Chinese Medicine (TCM), particularly EUO, offers a safer alternative through multi-level regulatory mechanisms. The study aims to uncover the molecular basis of EUO's therapeutic effects on ID by identifying active components, their targets, and associated biological pathways.

### 2. Methodological Framework
The research adopts a network pharmacology strategy, combining multiple databases and computational tools to achieve its objectives:
- **Active Ingredient Identification**: EUO's active components were筛选自TCMSP、ETCM 2.0、SymMap和TCM-ID四大数据库，通过设定口服生物利用度（OB≥30%）、药物相似性评分（≥0.80）等筛选标准，最终确定114种活性成分。
- **Target Selection for ID**: Immune dysregulation-related targets were derived from OMIM、GeneCards、CTD和NCBI基因数据库，通过关键词检索和严格评分标准（如GeneCards相关性得分≥30.0）筛选出850个潜在靶点。
- **Network Construction and Analysis**:
- **Overlap Analysis**: 通过Venny 2.1软件识别EUO与ID的110个共同靶点。
- **PPI网络构建**: 利用STRING数据库（置信度阈值0.7）建立蛋白互作网络，并通过Cytoscape的CytoNCA和MCODE插件进行关键节点筛选，最终确定TP53、AKT1、IL6和TNF为枢纽靶点。
- **功能富集分析**: DAVID数据库对GO（193项生物过程、25项细胞组分、107项分子功能）和KEGG（83条信号通路）进行富集分析，锁定“脂质与动脉粥样硬化”（HSA05417）为核心通路。
- **Molecular Validation**:
- **分子对接**: AutoDock Vina对核心成分（槲皮素、山柰酚、β-胡萝卜素）与靶点蛋白（TP53、AKT1、IL6、TNF）进行三维对接模拟，验证结合亲和力。
- **动态稳定性评估**: 通过GROMACS软件对AKT1-Kaempferol、IL6-Quercetin和TNF-Kaempferol三元复合物进行100纳秒分子动力学模拟，分析构象稳定性和氢键网络变化。

### 3. Key Findings
#### 3.1. Core Components and Binding Targets
研究识别出三大核心活性成分：
- **槲皮素（Quercetin）**: 与IL6结合能达-8.70 kcal/mol，显著抑制促炎因子释放，同时通过调控TP53通路调节细胞凋亡。
- **山柰酚（Kaempferol）**: 表现出广泛的靶点覆盖，其与AKT1的结合能（-8.59 kcal/mol）和TNF的结合能（-8.56 kcal/mol）均位列前茅，在炎症信号通路中发挥关键作用。
- **β-胡萝卜素（Beta-carotene）**: 兼具抗氧化与免疫调节功能，与IL6的结合能（-9.10 kcal/mol）为三者最高，同时通过维持脂质代谢平衡间接改善免疫状态。

#### 3.2. Pathway-Wide Mechanism
核心通路“脂质与动脉粥样硬化”（HSA05417）包含4个枢纽靶点（TP53、AKT1、IL6、TNF），形成多维度作用网络：
- **TP53**：调控脂代谢相关基因表达，抑制动脉粥样硬化斑块形成，同时通过诱导免疫耐受减少自身抗体生成。
- **AKT1**：抑制巨噬细胞过度活化，降低炎症因子IL-1β和TNF-α水平，其与山柰酚的强结合（-8.59 kcal/mol）可能直接阻断促炎信号传导。
- **IL6**和**TNF**：作为炎症级联反应的关键介质，β-胡萝卜素与IL6的结合能（-9.10 kcal/mol）显示其在抑制细胞因子风暴中起核心作用。

#### 3.3. Dynamic Stability of Protein-Ligand Complexes
分子动力学模拟揭示了关键复合物的稳定性特征：
- **Kaempferol-TNF系统**：结合自由能达-43.30 kcal/mol，在100 ns模拟中RMSD稳定在0.20-0.23 nm，表明该复合物具有高度动态稳定性。
- **Quercetin-IL6系统**：尽管结合能稍弱（-33.73 kcal/mol），但Ile218残基的范德华力贡献（-4.5 kcal/mol）显示其具有独特的空间适配性。
- **β-Carotene-IL6系统**：氢键网络变化较小（波动范围<5%），提示该复合物在动态环境下仍保持功能一致性。

### 4. Clinical Implications and Future Directions
#### 4.1. Therapeutic Potential of EUO Components
- **槲皮素**：在哮喘治疗中通过Th1/Th2平衡调节已被验证，本研究进一步揭示其通过抑制IL6分泌（结合能-8.70 kcal/mol）缓解慢性炎症。
- **山柰酚**：与AKT1（-8.59 kcal/mol）和TNF（-8.56 kcal/mol）的结合提示其在抑制炎症信号转导通路（如NF-κB）中具有潜力。
- **β-胡萝卜素**：除直接抑制IL6外，其抗氧化特性（通过清除ROS维持免疫细胞功能）可能协同其他成分产生增效作用。

#### 4.2. Limitations and Research Gaps
- **实验验证缺失**：当前研究依赖计算模型，需通过体外实验（如ELISA检测炎症因子）和体内模型（如 mouse with adjuvant-induced arthritis）验证靶点有效性。
- **通路协同效应待明确**：虽然HSA05417通路为核心，但其他KEGG富集通路（如Hepatitis B、Prostate cancer）与ID的关联机制需进一步探究。
- **成分剂量-效应关系不明**：需通过药代动力学研究确定不同活性成分的给药剂量和最佳作用时间。

#### 4.3. Translational Application Strategy
- **复方制剂开发**：结合槲皮素（抗炎）、山柰酚（免疫调节）和β-胡萝卜素（抗氧化）的协同作用，设计具有时空稳定性的纳米递药系统。
- **靶点特异性优化**：针对TP53的变构口袋（通过分子对接结果优化）设计新型黄酮类化合物，可能提升动脉粥样硬化抑制效果。
- **多组学整合验证**：建议后续结合转录组测序（分析炎症相关基因表达谱）和代谢组学（监测脂质代谢中间产物）完善机制模型。

### 5. Mechanistic Innovations
该研究突破传统单靶点理论，提出“脂质代谢-免疫稳态”双轴调控模型：
1. **脂质代谢轴**：通过抑制HSA05417通路中的胆固醇合成（关键节点TP53调控HMG-CoA还原酶）和促进逆向胆固醇转运（CTNNB1相关受体介导），改善动脉粥样硬化微环境。
2. **免疫信号轴**：靶向AKT1（mTOR通路）和IL6/TNF（JAK-STAT通路）形成级联调控网络，既抑制促炎因子风暴，又通过诱导调节性T细胞（Treg）恢复免疫平衡。

### 6. Comparative Advantage Over Existing Therapies
相较于激素和免疫抑制剂，EUO复方制剂展现出显著优势：
- **多靶点协同**：同时作用于炎症介质（IL6/TNF）、信号通路（AKT1/mTOR）、细胞凋亡（TP53）三个层面。
- **代谢可塑性**：通过调节脂质代谢关键酶（如HMG-CoA还原酶活性）实现“双向调节”——既抑制动脉粥样硬化斑块形成，又通过脂溶性成分增强肠道免疫屏障。
- **安全性优势**：传统剂量下未检测到肝酶升高（ALT/AST < 1.5倍上限），且其多糖成分可增强肠道菌群多样性（需实验验证）。

### 7. Ethical and Regulatory Considerations
- **质量控制标准**：需建立欧盟药典（Ph. Eur.）类似的活性成分指纹图谱，确保不同批次EUO制剂的稳定性。
- **适应症分层**：根据ID亚型（如自身免疫型vs感染诱导型）制定差异化给药方案，例如自身免疫性疾病可优先考虑槲皮素-IL6靶向组合。
- **临床前研究设计**：建议采用类器官模型（如人源化小鼠肠道免疫微环境模型）模拟ID病理过程，验证复方制剂的体内代谢规律。

### 8. Future Research Pathways
1. **靶点功能验证**：通过CRISPR-Cas9技术敲除TP53、AKT1等靶点，评估EUO复方制剂的免疫调节效果变化。
2. **空间构象动态研究**：结合冷冻电镜技术，解析EUO活性成分与靶点蛋白的构象变化规律。
3. **临床转化试点**：在难治性自身免疫病（如银屑病关节炎）患者中开展开放标签试验，评估复方制剂的疗效和安全性。

### 9. Cultural and Philosophical Implications
该研究体现了中医药“整体观”理论的现代科学转化。EUO的“多靶点-多途径”作用模式与《本草纲目》中“补中益气，解毒止痛”的描述高度契合，为构建“物质基础-作用靶点-整体效应”的TCM现代化理论提供了实证案例。这种将传统经验知识与现代系统生物学结合的研究范式，对推动中医药国际化具有方法论创新意义。

本研究通过整合网络药理学、计算生物学和分子动力学模拟技术，首次系统揭示了EUO治疗免疫失调的多层次机制。其创新性在于：
1. **构建脂质代谢-免疫调节双轴调控模型**
2. **发现山柰酚对AKT1/TNF双靶点抑制效应**
3. **建立动态稳定性评估体系（RMSD<0.25 nm，RMSF<0.60 nm）**
4. **提出“抗氧化-抗炎-免疫重塑”三位一体治疗策略**

这些发现不仅为开发新型免疫调节剂提供了理论依据，更开创了从传统方剂到精准化药物研发的系统方法论，对提升中医药的国际认可度具有重要实践价值。