高效且具有选择性的G蛋白偶联受体激酶5抑制剂：设计、合成、评价及X射线结构研究

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Potent and Selective G Protein-coupled Receptor Kinase 5 Inhibitors: Design, Synthesis, Evaluation, and X-ray Structural Studies

GRK5抑制剂设计与结构生物学研究揭示非共价结合机制及高选择性，基于吡咯啉酮骨架开发新型药物类似物，X射线结构解析助力优化治疗癌症和心脏疾病药物。

　　

Arun K. Ghosh | Rajesh Manda | Ranjith Kumar Gadi | Yueyi Chen | Natalie M. Galvan | John J.G. Tesmer

美国印第安纳州西拉斐特市普渡大学化学系，邮编47907

摘要

本文报道了一系列高选择性、强效、非共价且具有药物特性的G蛋白偶联受体激酶5（GRK5）抑制剂的设计。GRK5是治疗心力衰竭和癌症的重要靶点。以吡咯吲哚酮作为主要骨架，该骨架存在于FDA批准的口服抗癌药物苏尼替尼中，我们利用基于结构的设计方法生成了一系列非共价且具有药物特性的GRK5抑制剂。几种化合物对相关激酶GRK2表现出低纳摩尔浓度下的高选择性。通过测定GRK5-抑制剂复合物的三个高分辨率X射线晶体结构，我们获得了关于配体结合位点相互作用的见解。当前的结构-活性研究及X射线结构分析将进一步促进基于GRK5抑制剂的新疗法的开发，用于对抗癌症和心脏病。

引言

G蛋白偶联受体（GPCRs）是一大类信号蛋白，占人类基因组的很大比例。GPCRs几乎存在于人体中的所有细胞类型中，负责细胞外信号转导，调节多种重要的哺乳动物生理功能，包括视觉、嗅觉、神经传递和激素调节。GPCR激酶（GRKs）通过磷酸化激动剂激活的GPCRs的细胞内环和羧基末端尾部，在调节GPCR信号传导中起着关键作用。这些事件会触发一系列信号级联反应，最终导致受体脱敏。人类体内存在七种GRK亚型（GRK1-7），它们主要参与GPCRs的磷酸化和脱敏过程。尽管GPCR信号传导对细胞功能至关重要，但GRKs的失控活性会对细胞存活产生严重不良影响，从而导致许多人类疾病，包括心血管疾病、神经退行性疾病和癌症。在心力衰竭患者中，由于GRK2和GRK5的过度表达，调节心脏收缩力的GPCRs显著下调。研究表明，扩张型心肌病和容量超负荷患者的GRK2和GRK5水平异常升高。有趣的是，使用动物模型进行的GRK5敲低实验显示，心脏肥大发生延迟且心脏功能得以保留。因此，GRK5被认为可能是治疗心力衰竭和心脏肥大的潜在治疗靶点。此外，GRK5还与人类癌症（包括前列腺癌、胶质母细胞瘤和非小细胞肺癌）的发生和发展有关。尽管GRK5已被证明影响多种病理生理过程，但其确切作用和机制仍不明确。然而，鉴于GRK5在许多疾病病理中的作用，开发GRK5抑制剂已成为治疗心力衰竭和癌症的新策略。为了开发小分子GRK5抑制剂，确保化合物具有选择性以减少副作用和毒性至关重要。由于GRKs之间的高度同源性，尤其是它们的催化结构域，这一目标具有挑战性。早期的抑制剂开发策略依赖于变构抑制和共价抑制。我们最近通过在苏尼替尼核心结构上引入卤代乙酰胺基团，生成了不可逆的GRK5抑制剂。苏尼替尼是一种FDA批准的药物，可靶向受体酪氨酸激酶（图1）。代表性的氯代乙酰胺抑制剂显示出8.6 nM的GRK5 IC₅₀和1.2 μM的GRK2 IC₅₀，选择性超过1400倍。然而，这类化合物通常具有高反应性，可能会因与非目标生物亲核试剂的反应而产生副作用。我们通过基于结构的设计方法改进了这一点，开发出高效且可逆的共价GRK5抑制剂，其中酮酰胺衍生物对GRK2的选择性超过100,000倍（GRK5 IC₅₀为10 nM）。我们对GRK5与抑制剂复合物的X射线结构研究揭示了其与GRK5-Cys474之间形成了可逆的共价半缩醛中间体。随后，我们设计了一系列非共价的GRK5抑制剂，例如呋喃-3-羧酰胺衍生物，其对GRK5的选择性超过140倍（GRK5 IC₅₀为56 nM）。然而，这类化合物对GRK2的选择性有所下降。我们确定了GRK5与抑制剂复合物的多个X射线晶体结构，并揭示了GRK5活性位点中的有趣的非共价相互作用。基于这些发现，我们设计了能够与活性位点（AST）相互作用的杂环反向酰胺衍生物，AST是一个保守性较差的环结构，它穿过GRK的活性位点。在这项初步研究中，我们通过引入反向酰胺功能与GRK5的AST环相互作用，生成了高效、高选择性的非共价GRK5抑制剂。配体的立体化学性质影响了其效力和选择性。我们确定了该系列化合物与GRK5复合物的三个X射线晶体结构，为GRK5抑制剂的设计和优化提供了结构依据。

结果与讨论

我们最近确定了α-羟基呋喃基乙酰胺衍生物5（图2a）与GRK5复合物的X射线结构，该复合物来自α-羟基呋喃基中心的（1:1）非对映体混合物，结果显示(S)异构体具有明显的优先选择性（图2b）。因此，(S)异构体的IC₅₀为30 nM（针对GRK5），而(R)异构体分别为2.2 μM（选择性为70倍）和4.1 μM及7 μM。呋喃基团占据了一个靠近保守AST环的口袋中。

结论

我们设计、合成并评估了一系列非共价的GRK5抑制剂，这些抑制剂对GRK2表现出良好的效力和高选择性。在当前化合物系列中，我们通过将反向酰胺功能引入吡咯吲哚酮骨架来调节配体结合位点的相互作用。我们设计了含有小疏水取代基以及杂原子和杂环官能团的羧酰胺结构，以促进与GRK5的相互作用。

实验部分

所有试剂和溶剂均从商业渠道购买，未经纯化直接使用。¹H NMR使用300、400或500 MHz的谱仪记录，¹³C NMR使用100或125 MHz的谱仪。化学位移以DMSO-d6中的四甲基硅烷残基信号为参考：单峰（s）、双峰（d）、双峰中的双峰（dd）、三峰中的双峰（dt）、三峰（t）、四峰（q）、多重峰（m）、双双峰（dd）、双双双峰（ddd）。

CRediT作者贡献声明

Arun Ghosh：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、监督、资源提供、项目管理、方法学研究、资金获取、数据分析、概念构思。 John J. G. Tesmer：撰写——审阅与编辑、验证、监督、资源提供、项目管理、资金获取、数据分析。 Natalie M. Galvan：数据可视化、验证、软件应用、方法学研究、数据整理。 Yueyi Chen：撰写——审阅与编辑。

数据可用性

化合物6k、6s和6t与GRK5复合物的X射线晶体数据分别存储在PDB中，条目编号为9BRO、9BRM和9BRP。支持本文的光谱数据、测定结果和X射线数据见补充数据部分。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

感谢美国国立卫生研究院（HL071818和P30CA023168项目，J.J.G.T.和A.K.G.）、沃尔瑟癌症基金会以及普渡大学提供的财政支持。作者还要感谢普渡大学癌症研究所提供的NMR和质谱设施支持，以及Sandali Gamage、Kathryn McCauley和Ellen Wei在某些微管蛋白磷酸化抑制实验中的技术协助。