β,γ-不饱和羧酸合成衍生物的利什曼原虫和锥虫杀灭潜力

β,γ-不饱和羧酸衍生物合成及抗寄生虫活性研究：发现新型低毒抗利什曼原虫和克鲁兹锥虫化合物，通过线粒体损伤和氧化应激诱导凋亡机制。

　　
### 研究背景与意义
利什曼病（Leishmaniasis）和美洲锥虫病（Chagas disease）是由寄生虫感染引起的全球性 neglected tropical diseases（NTDs），对低收入地区人群健康造成严重威胁。利什曼病的传统治疗药物如 miltefosine 存在肝毒性、高成本及耐药性问题，而美洲锥虫病的现有疗法 benznidazole 则因疗效有限且副作用显著而难以推广。近年来，多样性导向合成（Diversity-Oriented Synthesis, DOS）成为药物研发的重要策略，通过快速构建结构多样的化合物库筛选活性分子，可显著提高新药发现的效率。

本研究团队通过β,γ-不饱和羧酸衍生物的多样性合成路线，合成了23种新型化合物（SET-01至SET-23），并系统评估了其对利什曼原虫（Leishmania amazonensis）和美洲锥虫（Trypanosoma cruzi）的杀灭活性，同时分析了其作用机制及安全性。结果显示，部分化合物不仅对两种寄生虫表现出显著活性，且对宿主细胞的毒性较低，提示其作为新型抗寄生虫药物的开发潜力。

### 研究方法与过程
#### 1. 化合物合成
研究团队基于β,γ-不饱和羧酸的核心骨架，通过 aldol 加成和后续氧化反应构建了多样化的衍生物库。具体步骤包括：
- ** Aldol缩合反应**：以不同醛类化合物为起始原料，通过亲核加成和酸催化缩合形成β,γ-不饱和羧酸衍生物。
- ** 氧杂嗪环化**：通过将β,γ-不饱和羧酸与 pivaloyl chloride 在三乙胺催化下反应，形成含氧杂嗪环的衍生物（N-酰基氧杂嗪啉-2-酮）。
- ** 功能基团修饰**：引入 tert-丁基二苯基硅醚（TBDMSO）、苯甲酰氧基（BnO）等取代基，优化化合物的脂溶性和生物相容性。

所有合成路径均通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）和红外光谱（IR）验证，确保产物纯度与结构准确性。最终合成的23种化合物涵盖5种核心结构类型（Family 2-8），其中12种为首次报道。

#### 2. 活性筛选与毒性评估
#### 2.1 抗寄生虫活性检测
- **体外模型**：使用利什曼原虫的 promastigote（感染期）和 amastigote（细胞内共生期）形式，以及美洲锥虫的 epimastigote（幼虫期）进行活性测试。
- **半数抑制浓度（IC??）**：通过AlamarBlue代谢活性检测试剂盒测定寄生虫抑制率。
- **选择性指数（SI）**：计算化合物对寄生虫的抑制率与宿主巨噬细胞毒性（CC??）的比值，评估其靶向性。

#### 2.2 毒性评价
采用 murine macrophages（J774A.1细胞系）评估化合物对宿主细胞的毒性。通过以下指标量化：
- **细胞膜完整性**：使用Sytox Green染色法检测细胞膜通透性。
- **线粒体功能**：通过JC-1染料测定膜电位（ΔΨm）及ATP水平。
- **氧化应激**：利用CellROX试剂检测活性氧（ROS）积累。
- **凋亡相关变化**：通过Hoechst 33342和PI双染色观察核染色质凝结及细胞凋亡特征。

### 关键研究结果
#### 1. 抗寄生虫活性
- **利什曼原虫**：
- SET-12（含苯甲酰氧基）和 SET-19（含TBDMSO基团）对 promastigote的IC??分别为12 μM和18 μM，显著优于现有药物 miltefosine（IC??>100 μM）。
- SET-12和SET-19对 amastigote的活性分别为IC??=3.8 μM和18.2 μM，选择性指数（SI）达34.5和4.7，表明其靶向感染期细胞的能力强于传统药物。
- **美洲锥虫**：
- SET-05（含苯甲酰氧基）和 SET-07（含异丙基苯基取代）对 epimastigote的IC??分别为6.8 μM和5.4 μM，较标准药 benznidazole（IC??=14 μM）更具选择性。

#### 2. 作用机制
- **能量代谢抑制**：
- SET-22显著降低利什曼原虫的ATP水平（仅20%于对照组），而SET-12虽未降低ATP，但通过线粒体膜电位损伤（ΔΨm降至40%）协同抑制寄生虫增殖。
- 美洲锥虫中，SET-07通过线粒体损伤（ΔΨm降至70%）和ATP消耗（60%于对照）双重机制发挥作用。
- **氧化应激与膜通透性破坏**：
- 所有活性化合物均诱导ROS积累（>85%荧光标记率），提示活性氧介导的细胞凋亡。
- SET-12和SET-22使利什曼原虫的膜通透性分别达85%和65%，表明其通过破坏细胞膜选择性渗透。
- **核凋亡特征**：
- SET-19和SET-22诱导利什曼原虫的核染色质高度凝结（>80%荧光标记），而SET-07对美洲锥虫的凋亡诱导效果显著（PI阳性细胞达80%）。

#### 3. 安全性分析
- **宿主细胞毒性**：所有活性化合物的CC??均高于100 μM，表明对巨噬细胞毒性极低（如SET-12 CC??=131 μM）。
- **选择性优势**：SET-12对利什曼原虫的SI（34.5）远超miltefosine（23.1），而SET-07对美洲锥虫的SI（8.38）接近benznidazole（57.5）。

### 结构-活性关系（SAR）
1. **氧杂嗪环的必要性**：仅含氧杂嗪环的化合物（Family 2-8）显示活性，不含该环的SET-04、SET-05等例外可能因空间位阻或电子效应导致活性降低。
2. **取代基的影响**：
- **β位取代基**：苯基（Ph）和异丙基（i-Pr）取代可增强活性，而氯代基团（Cl）因极性过强可能降低渗透性。
- **γ位修饰**：引入TBDMSO基团（-O-TBDMS）可提高脂溶性，增强对寄生虫生物膜的亲和力。
3. **立体异构**：SET-12的顺式构型（(R*,E)-2-((S*)-1-羟基乙基)hex-3-enoate）活性优于反式异构体，提示手性中心对药效的重要性。

### 研究创新点
1. **新型骨架应用**：首次将β,γ-不饱和羧酸衍生物的oxazolidinone骨架应用于抗寄生虫药物开发，突破了传统异烟肼和苯胺酸类药物的结构限制。
2. **多靶点作用机制**：发现化合物通过线粒体损伤（膜电位降低）和氧化应激（ROS积累）双重途径诱导寄生虫凋亡，为设计广谱抗寄生虫药物提供新思路。
3. **低毒性潜力**：SET-12和SET-07的CC??分别达131 μM和45.6 μM，提示其可能成为下一代低毒抗寄生虫药物候选。

### 局限性与展望
1. **局限性**：
- 实验仅基于体外模型，需进一步验证体内疗效。
- 部分高活性化合物（如SET-22）的长期毒性未明确。
2. **未来方向**：
- 优化手性合成路径，制备单一立体异构体以提升活性。
- 探索化合物对寄生虫不同生活周期的交叉活性（如虫卵阶段）。
- 结合计算机辅助药物设计（CADD）筛选更高选择性的衍生物。

### 结论
本研究通过多样性导向合成策略，成功开发了具有高选择性、低毒性的新型抗寄生虫化合物。其中，SET-12和SET-19对利什曼原虫的活性显著优于现有疗法，而SET-07对美洲锥虫的靶向性表现突出。这些化合物的多重作用机制（线粒体损伤、ROS积累、膜通透性破坏）为开发广谱抗寄生虫药物提供了理论依据。后续研究需聚焦于体内疗效验证及结构优化，以推动候选药物的临床转化。