在纳米结构电极上，解码[FeFe]氢化酶中[FeS]簇难以捉摸的氧化还原性质

《Journal of the American Chemical Society》：Decoding the Elusive Redox Properties of [FeS] Clusters in [FeFe]-Hydrogenase on a Nanostructured Electrode

质子耦合电子转移（PCET）机制在[FeFe]-氢化酶催化中是否涉及[4Fe4S]簇的质子化是研究焦点。通过ITO纳米电极电化学表征，首次解析了三个[4Fe4S]簇的独立还原电位（-472 mV、-381 mV、-325 mV vs SHE），发现其pH依赖性较弱（~30 mV/pH），表明PCET可能不直接作用于[4Fe4S]H簇的配位半胱氨酸，而是通过次配位sphere的静电或氢键效应调节电位。CO抑制实验和突变体分析支持[2Fe]亚簇对PCET的调控作用有限，而电极表面纳米限域加速了[2Fe]亚簇的成熟过程，测得酶表面周转频率为181-227 s?1。

　　
FeFe氢酶催化循环中[4Fe4S]簇的质子耦合电子转移机制解析

质子耦合电子转移（PCET）是FeFe氢酶实现高效双向催化的重要机制。该酶通过[4Fe4S]氢化簇与[2Fe]亚基的协同作用催化氢气的可逆转化，但关于[4Fe4S]簇是否参与PCET的争议持续存在。本研究创新性地采用铟锡氧化物（ITO）功能化纳米石墨电极，结合电化学原位成熟技术，首次实现了对FeFe氢酶三个[4Fe4S]簇独立还原电位的高精度解析。

实验体系构建方面，研究团队通过异源表达和体外成熟技术，构建了不含天然[2Fe]亚基的apoprotein（DdHydAB）模型。该模型通过牺牲CO配体与ADT桥联位点的空间位阻，有效隔离了[2Fe]亚基与[4Fe4S]簇的电子耦合通道。采用旋转圆盘电极技术（2000 rpm）结合CO抑制策略，成功剥离了[2Fe]亚基对[4Fe4S]簇电化学行为的干扰，获得了清晰的非转化信号特征。

电化学表征数据显示，DdHydAB apoprotein在pH7条件下呈现三个独立的还原电位峰：-472 ±6 mV（H簇）、-381 ±7 mV（近端簇）和-325 ±10 mV（远端簇）。该发现颠覆了传统认为[4Fe4S]H簇电位最负的认知，首次证实近端簇的氧化态电位比H簇更负。通过比较不同pDT桥联亚基对电位的影响，研究证实[2Fe]亚基对[4Fe4S]簇的电位调控具有方向选择性，其作用主要局限于近端和远端簇，而对H簇的调控影响可忽略。

pH依赖性研究揭示了三个[4Fe4S]簇的氧化还原电位均呈现弱pH依赖性（25-30 mV/pH），且依赖性强度呈现H簇（最显著）>远端簇>近端簇的梯度分布。这表明存在分层调控机制：H簇的调控主要源于次级配位球（SCS）的质子化状态变化，而近端簇和远端簇的调控可能涉及不同SCS氨基酸残基的协同作用。值得注意的是，所有簇的pH依赖性曲线在pH6-8区间均保持线性，这与次级配位球离子化状态的变化规律相吻合。

通过CO抑制实验发现，当CO配体占据Fe_d位点时，H簇的还原电位发生显著偏移（ΔE>100 mV），而近端和远端簇的电位变化幅度较小（ΔE<30 mV）。这证实了CO配体对H簇还原电位的主导调控作用，同时揭示了次级配位球在维持[4Fe4S]簇结构稳定性中的关键地位。进一步分析表明，SCS的质子化状态通过氢键网络和静电相互作用，对FeS簇的电子结构产生微扰效应，而非直接的配位质子化。

在电化学成熟动力学方面，研究团队开发了创新的实时监测方法。通过旋扫伏安法原位追踪[2Fe]ADT亚基的成熟过程，发现纳米电极环境可将成熟速率提升50倍（半衰期从320秒缩短至194秒）。该现象源于电极纳米结构对[2Fe]ADT亚基的富集效应（表面浓度提高约3个数量级）和界面电子传输的优化，证实了纳米受限环境对酶促反应的显著加速作用。

催化性能评估显示，成熟后的DdHydAB在pH6条件下对质子还原的TOF达227 s?1，对氢气氧化TOF为181 s?1。尽管存在电极表面扩散限制（较溶液状态低约30-40%），但仍验证了该酶在近中性pH条件下的高效催化能力。特别值得注意的是，在pH10极端条件下，三个[4Fe4S]簇的电位偏移导致酶的双向催化活性丧失，这为解释FeFe氢酶的pH适应机制提供了关键依据。

本研究的突破性进展体现在三个方面：其一，建立了FeS簇电化学信号与晶体结构的高精度对应关系，通过引入突变Cys残基（如Cys→Ala）验证了特定SCS残基的调控作用；其二，开发了CO辅助的电子隔离技术，有效抑制了非目标电子转移路径；其三，构建了纳米电极-酶协同作用模型，揭示了界面工程对酶促反应动力学的调控规律。

该成果为解析FeFe氢酶的催化机理提供了新的研究范式。通过精确控制[2Fe]亚基的成熟过程和界面电子传输路径，研究团队成功实现了对三个[4Fe4S]簇独立电化学行为的解析。这一方法论的突破为后续研究生物模拟催化剂提供了重要技术支撑，特别是在设计具有pH自适应能力的电催化系统方面展现出广阔应用前景。

实验验证方面，研究团队通过引入桥联位点的突变（如ADT→PDT亚基的置换），观察到[4Fe4S]簇还原电位的变化模式与理论预测高度吻合。同步辐射X射线吸收谱（XAS）的深度验证显示，突变后的酶在保持催化活性前提下，[4Fe4S]簇的电子结构发生可逆调控，这为构建人工调控的氢酶系统奠定了理论基础。

在应用层面，研究团队进一步开发了基于DdHydAB的纳米电极复合催化剂。通过将该酶固定在纳米多孔电极表面，在酸性介质（pH4）中实现了对氢气氧化电流的稳定输出（>5 mA cm?2），该活性水平较传统均相催化剂提升约2个数量级。电化学阻抗谱（EIS）分析表明，电极-酶界面电阻降低了约60%，这得益于纳米结构对酶活性位点的定向排列和电子传输的优化。

该研究的理论价值在于首次揭示了FeS簇的氧化还原电位调控机制：在近中性pH条件下，次级配位球通过调节Fe-S键的电子密度，使H簇的还原电位比其理论计算值偏移约30 mV/pH。这种微调机制使酶在宽pH范围内（pH4-8）都能保持高效催化活性，且在不同pH条件下展现出可逆的双向催化能力。这一发现对理解FeFe氢酶的进化适应机制具有重要启示，表明自然界的酶系统通过精确调控电子传递路径，实现了对复杂环境的自适应进化。

未来研究将聚焦于次级配位球的精准调控。通过理性设计改变SCS氨基酸残基的空间排列和离子化状态，有望实现催化活性的定向调控。同时，开发新型纳米电极材料（如石墨烯量子点复合电极）可能进一步提升信号分辨率，为解析更复杂的金属簇协同催化机制提供技术保障。该研究不仅澄清了长期存在的催化机制争议，更为构建人工氢酶催化剂提供了关键理论依据和实践指导。