共栖菌Peptoniphilus harei通过TLR2/CD14信号通路诱导单核细胞活化揭示其潜在致病性

《Medical Microbiology and Immunology》：Commensal Peptoniphilus harei induce activation of monocytes via TLR2/CD14 signalling in whole blood

本研究针对革兰阳性厌氧球菌(GPAC)在菌血症/脓毒症中免疫激活机制不清的问题，通过比较Peptoniphilus harei、Parvimonas micro与大肠杆菌(E. coli)对全血中单核细胞的激活作用，发现P. harei可通过TLR2/CD14信号通路显著诱导单核细胞活化标志物(PDL1、HLA-DR、CD11b)表达、信号通路分子(NF-κB p65、p38、Akt)磷酸化及炎症因子(IL-1β、TNF、IL-6)产生，其强度甚至超过常见革兰阳性菌，提示这类共栖菌在特定条件下具有引发全身炎症的潜在风险。

　　

在人体微生物群中默默无闻的革兰阳性厌氧球菌(GPAC)，近年来在临床血培养标本中检出率逐渐上升，尤其Parvimonas micro和Peptoniphilus harei成为血液感染中最常见的GPAC物种。然而，由于这类细菌生长缓慢、培养困难，且常出现在混合感染中，它们驱动免疫炎症反应的能力及机制一直被忽视。当细菌进入血液引发菌血症，可能过度激活免疫细胞导致脓毒症——一种危及生命的器官功能障碍综合征。其中，单核细胞作为天然免疫的核心力量，通过模式识别受体（如Toll样受体，TLR）感知病原体相关分子模式(PAMP)，启动炎症因子风暴。不同细菌激活单核细胞的途径和强度各异，例如革兰阴性菌主要依赖TLR4，而革兰阳性菌则更多通过TLR2。那么，GPAC这类“低调”的共栖菌，是否具备“高调”激活免疫细胞的潜力？它们与常见病原体如大肠杆菌(E. coli)相比有何异同？解答这些问题对理解GPAC的致病机制及脓毒症的精准防治具有重要意义。

为此，瑞典隆德大学的研究团队在《Medical Microbiology and Immunology》发表论文，系统比较了P. harei、P. micro和E. coli对全血中单核细胞的激活效应。研究采用热灭活细菌或其条件培养基(CM)刺激健康捐献者外周血，通过多参数流式细胞术分析单核细胞表面标志物表达、信号通路磷酸化及细胞内因子产生；利用抗CD14/TLR2阻断抗体探讨激活机制；并通过蛋白质凝胶电泳与液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定CM中潜在活性成分。

主要技术方法概述

研究使用热灭活细菌或条件培养基刺激肝素抗凝的健康人全血，通过流式细胞术检测单核细胞表面活化标志物（CD14、HLA-DR、CD11b、PD-L1）、信号通路磷酸化（NF-κB p65、p38、Akt）及细胞内细胞因子（IL-1β、TNF、IL-6、IL-8）；采用槽印迹结合实验分析细菌与CD14/TLR2的相互作用；通过SDS-PAGE和质谱技术鉴定条件培养基中的蛋白质成分。

P. harei是全血中单核细胞的强效激活剂

如图1所示，热灭活P. harei可显著上调单核细胞PD-L1、HLA-DR和CD11b表达，下调CD14，并诱导NF-κB p65、p38和Akt磷酸化及IL-1β、IL-6、TNF产生，其活化强度明显高于P. micro，部分指标甚至接近E. coli。活菌实验进一步验证了这一趋势。

P. harei激活单核细胞主要依赖CD14信号

尽管P. harei和P. micro表面均表达脂磷壁酸(LTA)，但槽印迹显示P. harei与CD14结合强烈，而与TLR2结合微弱（图2A-B）。抗体阻断实验表明，抗CD14可显著抑制热灭活P. harei引起的PD-L1和HLA-DR上调，而抗TLR2作用较弱（图2C），提示细菌表面成分主要通过CD14触发单核细胞活化。

P. harei条件培养基通过TLR2信号激活单核细胞

与热灭活细菌不同，P. harei CM激活单核细胞的作用被抗TLR2抗体显著抑制，而抗CD14效果有限（图3-4）。CM同样诱导单核细胞活化标志物表达、信号分子磷酸化及细胞因子产生，且强度与E. coli CM相当，说明P. harei分泌的可溶性成分通过TLR2通路发挥作用。

质谱鉴定揭示潜在活性蛋白

对P. harei CM中三个主要蛋白条带进行质谱分析，鉴定出丙酮酸合酶（约130 kDa）、SLH结构域蛋白（约110 kDa）及醛脱氢酶B/乙醇酸氧化酶（约55 kDa）（图4C）。STRING网络分析显示这些蛋白参与细菌代谢及潜在毒力相关通路，可能是触发免疫反应的关键分子。

免疫细胞激活非单核细胞特有

研究还发现P. harei同样激活中性粒细胞，上调CD66b、CD11b并下调CD16（图5）。热灭活细菌的激活依赖CD14，而CM依赖TLR2，与单核细胞模式一致，表明P. harei的免疫刺激作用具有广谱性。

结论与意义

本研究首次揭示P. harei可通过不同机制（细菌表面成分依赖CD14、分泌成分依赖TLR2）强效激活单核细胞和中性粒细胞，其强度超过常见革兰阳性菌甚至部分指标比肩E. coli。这一发现打破了GPAC为“无害共栖菌”的传统认知，提示其在菌血症/脓毒症中可能扮演重要角色。鉴定出的分泌蛋白为后续探究GPAC致病机制提供了靶点，而CD14/TLR2信号通路的识别为过度炎症的干预提供了新思路。未来需进一步验证候选蛋白的免疫激活功能，并扩大GPAC物种筛查以全面评估其临床风险。