基于立体光刻3D打印的微图案化技术揭示内皮-间质转化中细胞手性的力学生物学研究

《Annals of Biomedical Engineering》：Development of a Stereolithography 3D Printing-Based Micropatterning Method to Study Endothelial-to-Mesenchymal Transition Mechanobiology

本研究针对内皮-间质转化（EndMT）机制研究中微图案化技术成本高、操作复杂的问题，开发了一种基于立体光刻（SLA）3D打印的PDMS蛋白印章平台，通过定制ECM蛋白图案发现TNF-α诱导的HAECs细胞手性改变（偏移约18°），为EndMT提供了新型力学标志物，对心血管疾病治疗策略开发具有重要意义。

　　

心血管疾病（CVD）是全球死亡的首要原因，每年导致约1790万人死亡。在这一复杂的疾病网络中，内皮-间质转化（EndMT）逐渐崭露头角，成为动脉粥样硬化、心肌纤维化和血管钙化等病理过程的关键机制。EndMT指的是内皮细胞在分子层面发生转变，失去其特有的“铺路石”形态和功能标志物（如CD31、VE-钙黏蛋白），转而获得间质细胞的特性，包括表达α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）等，并伴随迁移和侵袭能力增强。这一过程不仅参与疾病进展，也是胚胎发育中产生间充质干细胞的重要环节，因此在再生医学中具有广阔前景。

然而，目前EndMT的鉴定主要依赖分子标志物的表达变化，但这些标志物在不同语境和转化阶段存在差异，使得精确捕捉EndMT的连续过程变得困难。此外，细胞的功能特性，如迁移能力和手性（细胞固有的左右不对称性），可能为EndMT提供更灵敏的检测指标。细胞手性已被证实是细胞骨架组织的重要特征，受细胞外基质（ECM）组成和物理信号影响。静息状态的内皮细胞通常没有明显的方向性偏好，而间质细胞则表现出极化迁移和内在手性。例如，未发生EndMT的内皮细胞在纤维连接蛋白（fibronectin）图案上培养时，会表现出逆时针方向的取向偏好。尽管手性在其他细胞类型中有所研究，但其作为EndMT力学生物学标志物的潜力尚未被充分探索。

另一方面，力学因素和ECM组成已知可调控EndMT。例如，低剪切力和增加的基质刚度会促进间质转化，促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）也有类似作用。基质的结构特性，如蛋白质类型、刚度和空间排列，进一步影响细胞对这些信号的响应。然而，研究ECM几何结构与细胞行为之间相互作用的技术，如光刻和软光刻，通常依赖昂贵、专业的设备，限制了其广泛应用。

为了解决这一技术瓶颈，研究人员开发了一种新颖、灵活且成本效益高的微图案制备平台。该平台基于立体光刻（Stereolithography, SLA）3D打印技术制作聚二甲基硅氧烷（PDMS）蛋白印章，能够创建可定制的ECM微图案，从而研究EndMT过程中的细胞手性变化。

本研究主要采用了以下几项关键技术方法：首先，利用计算机辅助设计（CAD）建模和SLA 3D打印机制作微图案模具，并以此生产PDMS印章；其次，使用人主动脉内皮细胞（HAECs）作为模型，通过TNF-α（50 ng/mL）处理诱导EndMT；接着，将纤维连接蛋白以条纹图案形式微印到细胞培养表面，并接种细胞；最后，通过免疫荧光染色（DAPI标记细胞核）和自定义的CellProfiler图像分析流程，量化细胞核的取向角度，以此表征细胞手性。

树脂打印实现可定制、高效且空间精确的印章模具微加工

通过使用HeyGears和FormLabs树脂打印机，研究人员成功打印了自定义的CAD模具。打印时间根据图案大小和复杂度，通常在8至12小时之间。模具经过异丙醇清洗和超声处理去除残留树脂，再经紫外线固化后，其有效分辨率达到100微米。PDMS印章的制作需一天时间完成固化。整个微加工流程使得用户能在两天内完成从模具打印到PDMS印章制备的全过程。

微加工印章成功图案化纤维连接蛋白并促进细胞按图案粘附

质量检测合格的印章被用于细胞实验。通过荧光标记的纤维连接蛋白验证了印章图案的准确性。将HAECs接种到微图案化的培养板上后，24小时内可观察到细胞在纤维连接蛋白图案区域的特异性粘附和增殖。在测试的多种图案中，条纹图案比相同宽度的棋盘格图案产生更一致的结果，因此被选用于后续的细胞手性分析。

TNF-α诱导EndMT并影响细胞手性

TNF-α处理导致HAECs形态发生显著变化，从典型的鹅卵石状转变为纺锤形的间质样细胞形态。在分子水平上，TNF-α显著下调了内皮标志物内皮型一氧化氮合酶（ENOS3）的基因和蛋白表达，同时上调了间质标志物N-钙黏蛋白（由CDH2基因编码）和转胶蛋白（transgelin, TAGLN）的表达，证实了EndMT的成功诱导。

在细胞手性分析方面，研究人员利用自定义的CellProfiler流程，比较了TNF-α处理与未处理的HAECs在纤维连接蛋白条纹图案上的取向。通过识别DAPI染色的细胞核，拟合椭圆并分析其长轴相对于条纹垂直轴的角度，绘制了玫瑰图。综合分析9次独立实验的数据发现，未处理的对照组HAECs的平均取向为-13.4°，而TNF-α处理组的平均取向变为+4.5°，意味着细胞群体的偏好方向发生了约17.9°的显著偏移（p < 0.00025）。这一结果表明，细胞手性在EndMT过程中发生了改变。

完整的微加工、细胞培养和图像分析流程助力EndMT研究

本研究成功构建了一个集微加工、细胞生物学实验和高通量图像分析于一体的完整技术平台。该平台的核心创新在于利用低成本、易获取的SLA 3D打印技术替代了传统的昂贵光刻设备，实现了PDMS蛋白印章的快速、灵活制备。结合自动化的图像分析软件，研究人员能够高效、准确地量化细胞在特定ECM图案上的手性行为。

研究结论与讨论部分指出，本研究开发了一种经济高效、省时省力的技术流程，可用于研究EndMT的力学生物学，特别是通过微图案化基质蛋白来评估发生EndMT的内皮细胞的细胞手性。利用该平台，研究人员证实TNF-α能诱导HAECs发生EndMT典型的分子改变，并首次揭示这种处理还会导致内皮细胞偏好取向的显著变化，支持了细胞手性作为EndMT功能性标志物的观点。在动脉粥样硬化等炎症性心血管疾病中，存在TNF-α等促炎因子，它们会促进EndMT过程。因此，细胞手性这一易于在图像中解读的标志物，未来有望应用于旨在逆转或减轻EndMT的药物筛选试验中，并易于扩展到高通量平台。

本研究最重要的贡献在于其微图案化方法。与传统的光刻技术相比，SLA树脂打印机（如FormLabs打印机价格在2000至15000美元之间）成本显著降低，且用途广泛。该方法高度可定制，为实验设计提供了灵活性。当然，该方法也存在一些局限性，例如图案分辨率（约100微米）尚不能达到最高水平，印章应用过程中可能因人为操作导致图案模糊，以及整个流程的规模化能力有限等。未来的研究计划利用该平台进一步探索HAECs对其他EndMT诱导剂的反应，结合多种诱导剂研究手性的分子调控机制，延长培养时间以观察手性变化对细胞功能（如迁移）的影响，并尝试其他印章图案以考察其对EndMT易感性的差异。

总之，本研究开发的技术、方法及其初步发现，为生物工程学和力学生物学领域提供了易用的微图案化制备工具，并揭示了一个新的EndMT功能性生物标志物，对心血管疾病的基础研究和治疗策略开发具有积极意义。