综述：长链非编码RNA和环状RNA在自闭症谱系障碍分子发病机制中的调控功能

《Cellular and Molecular Neurobiology》：Regulatory Functions of Long Non-coding RNAs and Circular RNAs in the Molecular Pathogenesis of Autism Spectrum Disorder

本综述系统阐述了长链非编码RNA（lncRNA）和环状RNA（circRNA）在自闭症谱系障碍（ASD）分子发病机制中的关键作用。文章整合了遗传学、表达谱和功能机制研究，揭示了这些非编码RNA通过调控神经元分化、突触功能和免疫通路影响ASD病理进程。作者指出，深入解析lncRNA和circRNA的复杂调控网络，有望为ASD的诊断生物标志物开发和靶向治疗策略提供新视角。

　　

引言

自闭症谱系障碍（ASD）是一种复杂的神经发育状况，其特征包括社交沟通障碍、兴趣受限和重复行为。其病因复杂，涉及遗传和环境因素的相互作用。双生子研究 consistently 表明ASD具有很高的遗传度，估计在0.64到0.91之间。尽管早期研究主要集中在蛋白质编码基因上，但越来越多的证据表明，非编码RNA，特别是长链非编码RNA（lncRNA）和环状RNA（circRNA），在ASD的病理生理学中扮演着关键角色。早期的基因组分析发现，与ASD相关的常见变异经常位于非编码区域，这促使研究人员探索这些区域如何影响基因调控。

自闭症谱系障碍的神经发育框架

ASD被确认为一种复杂的神经发育状况，通常在儿童早期显现。其核心特征在不同个体间存在显著差异。研究越来越强调遗传易感性和环境影响因素在塑造ASD特质方面的相互作用。大脑多个关键区域，如与社会认知、语言和执行功能相关的脑区、杏仁核以及小脑，其结构异常与ASD行为相关。此外，ASD还涉及大规模神经网络（如默认模式网络）内部功能连接的破坏，以及神经递质（如γ-氨基丁酸和谷氨酸）的失衡，这些都改变了大脑中的兴奋-抑制信号。这些发现共同表明，ASD是由多种相互作用因素共同塑造的，而非单一局部的功能紊乱。

长链非编码RNA的遗传学研究

LncRNAs是长度超过200个核苷酸且不具有蛋白质编码潜力的转录本。它们从基因组内的不同位点转录而来，并在多个层面影响基因表达。在细胞核内，它们可以通过招募染色质和转录因子来调节转录，作为反义调节因子或增强子相关RNA顺式或反式发挥作用，并调节RNA加工（剪接、编辑和降解）。在细胞质中，lncRNAs通过与mRNA碱基配对、作为RNA结合蛋白的诱饵或支架、或作为竞争性内源RNA（ceRNA）吸附miRNA来调节翻译。

早期研究ASD遗传学的努力识别出主要位于非编码区域的常见变异。首个该领域的遗传学研究检查了一个受多种精神障碍影响的家族，证明拷贝数变异（CNV）会影响多种精神障碍（包括ASD）的风险。该研究鉴定出在一个非编码RNA（AK127244）基因组区域的缺失，该区域位于NRXN1（neurexin 1）基因位点上游，与精神病理表型相关。随后的研究分析了5p14.1染色体上ASD相关的非编码区域，基于细菌人工染色体（BAC）的增强子捕获策略，研究人员发现该区域作为一个大脑特异性增强子，在神经发育过程中调节灵长类特异性的lncRNA MSNP1AS（moesin pseudogene 1, antisense）的表达。这表明该区域的常见遗传变异可能通过改变MSNP1AS的时空表达来影响ASD易感性。

另一项研究分析了与ASD相关的特定遗传位点，检查了染色质重塑基因家族KDM5的表达，并鉴定出一种KDM5C亚型（KDM5C-3'-UTR-lncRNA），其包含一个源自自体甲基转移酶（SUV39H2）的逆转座基因（retro-SUV39H2）的新型3'非翻译区。这个3'非翻译区与lncRNAs具有序列同源性，并且在具有X染色体失活偏斜的自闭症女性中差异表达。研究人员提出，这种lncRNA连接了两个染色质重塑组件，可能对ASD病因学有所贡献。

研究也探讨了lncRNA序列中的单核苷酸多态性（SNP）与ASD的关联。首个此类研究发现HOX转录反义RNA（HOTAIR）内的一个特定SNP（rs12826786）与ASD风险相关。另一项研究分析了位于INK4位点中的反义非编码RNA（ANRIL）附近的四个SNP，以确定它们与ASD风险的关联。虽然等位基因、基因型或单倍型频率在ASD病例和对照组之间未观察到显著差异，但有两个单倍型显示出与ASD风险相关的趋势。

最近的研究引入了SNATCNV工具来分析CNV与遗传疾病的关联。通过将该工具应用于ASD队列，研究人员在重复复制或删除的ASD候选区域中识别出一组大脑富集的编码和lncRNA基因，表明其与ASD潜在相关。另一项研究利用双生子研究中ASD个体的基因组变异数据，识别出532个ASD相关的lncRNAs。通过富集分析，作者研究了这些lncRNAs的功能和相关通路，确定它们参与了多个生物学过程，包括神经系统发育、化学突触传递和免疫反应。

最近的研究开始将非编码元件与更广泛的神经发育基因网络联系起来。Andersen及其同事利用平衡染色体重排暗示了多个lncRNAs作为发育表型的潜在驱动因素。他们表明，敲低TBX2-AS1或MEF2C-AS1会适度但显著地降低其邻近转录因子的表达，这与对核心调节因子进行顺式微调是一致的。在后续研究中，对ASD风险基因的大规模功能性干扰揭示了跨扰动位点的转录组收敛，表明编码和非编码扰动可能收敛于重叠的调控网络。这些证据共同表明，lncRNA变异不仅通过单个位点，而且通过与已确立的蛋白质编码通路相交的网络级效应来贡献ASD风险。

长链非编码RNA的表达研究

通过比较健康个体和患者生物组织中的基因表达，可以识别疾病相关基因。多项研究基于此方法探索了与ASD相关的lncRNAs。第一项研究检查了ASD患者死后脑组织中的调控性lncRNAs。研究人员发现，超过200个lncRNAs在ASD脑组织中表现出差异表达，并且富集在有助于神经发育和精神障碍的基因组位点。作者提出，这些lncRNAs的反式调控机制是其细胞功能的关键贡献者。随后的研究同样利用ASD患者的死后脑组织来分析转录组和剪接改变。研究人员通过RNA测序测量基因表达变化，包括lncRNAs。他们的发现表明有60个lncRNAs在ASD中失调，其中三分之一与miRNA通路相关，9个与脆性X信使核糖核蛋白（FMRP）相关。基于这些分析，预计ASD中的lncRNA失调可能与miRNA和FMRP相关机制存在联系。

研究人员聚焦于先前确定的ASD相关基因，研究了这些基因及其天然反义转录本在小鼠发育过程中两个脑区（内侧前额叶皮层和纹状体）的差异表达。研究揭示，超过70%的ASD相关基因拥有反义转录本，表明它们可能受到反义介导的基因调控。有趣的是，某些ASD相关基因及其反义转录本在不同发育阶段的内侧前额叶皮层和纹状体之间表现出差异表达。由于该研究利用组织特异性注释为小鼠大脑组装了一个全新的反义转录组，这些信息可能增强对天然反义转录本调控ASD相关基因的理解。

胃肠道症状在ASD儿童中很常见；慢性便秘是最常报告的问题，家长通常描述其为特别棘手的问题。一组研究人员调查了患有ASD和慢性便秘的儿童的基因表达谱。他们识别出两个不同的临床亚组，即对抗炎治疗快速反应者和慢速反应者。与快速反应者相比，慢速反应者显示出参与血清素降解和线粒体功能障碍的基因表达改变，表明结肠运动受损可能是潜在机制。值得注意的是，lncRNA Xxbac.B476C20.9被确定为预测治疗反应的潜在生物标志物，为个性化治疗策略提供了前景。

比较患者血液样本中的基因表达是识别潜在生物标志物的一种方法。一项早期研究采用此方法，检测了中国ASD患者外周血细胞中lncRNAs和mRNAs的差异表达。研究人员识别出3929个差异表达的lncRNAs，其中2407个上调，1522个下调。研究结果表明，差异表达的lncRNAs可作为早期检测ASD的生物标志物。另一项研究表征了ASD个体血浆中循环ncRNAs的表达模式，以识别与ASD严重程度相关的生物标志物。研究人员鉴定出几种ASD特异性的循环ncRNAs，其中一些与严重或轻微症状组相关。他们的发现表明循环ncRNAs可以作为诊断生物标志物和临床靶点。

其他研究在血液样本中进行详细表达比较之前，先对lncRNAs进行了筛选。一项研究评估了ASD儿童外周血中三种lncRNAs（NEAT1、PANDA和TUG1）的表达水平。研究人员报告称，NEAT1和TUG1在ASD患者血液中显著上调。此外，在ASD患者和健康对照中，这些lncRNAs的相对表达水平观察到显著相关性。同一研究小组分析了ASD儿童外周血中IFNG和IFNG-AS1表达水平的改变。研究结果表明，与健康对照相比，ASD患者中IFNG表达显著升高，而IFNG-AS1表达降低。这些结果暗示了这两个基因在ASD发病机制中存在调控关系。

长链非编码RNA的机制研究

机制研究揭示，ASD相关的lncRNAs通过一系列众所周知的调控过程发挥作用，从而导致神经元发育和功能的调节。这些过程包括对突触支架和细胞骨架成分的反义介导调控、神经发育基因程序的转录或染色质水平控制、作为ceRNA调控信号通路以及调控剪接过程。

神经元基因的反义介导调控是ASD相关lncRNAs中一个公认的机制。通过在人神经祖细胞中进行功能获得和功能丧失研究，发现自闭症相关的lncRNA MSNP1AS能够重塑神经突形态以及与粘附、轴突导向和突触发生相关的基因程序。MSNP1AS抑制Moesin并影响RhoA/Rac1和PI3K/Akt信号通路，直接将反义调控与细胞骨架控制联系起来，并解释了观察到的神经突长度、迁移和细胞活力的变化。

类似地，Shank2-AS是突触支架基因Shank2的反义转录本，在ASD中上调而Shank2下调。Shank2-AS的过表达减少了神经突的生长和分支，这可能是通过形成双链RNA抑制正义链表达来实现的。这些研究支持了一个共享的反义机制，即lncRNA-靶基因配对导致神经元结构的调节。

LncRNAs还通过染色质水平和转录控制来调控谱系特异性和突触基因的表达。Lnc-NR2F1的基因位点因一处神经发育易位而被打断，它结合富含bHLH基序的基因组区域并驱动促神经源性程序。研究发现，lnc-NR2F1的过表达增加了诱导神经元中的神经突长度。作为另一个案例，ASD风险基因CHD8的神经元抑制会失调RAB11B-AS1的表达，而这反过来又增加了RAB11B蛋白，暗示了lncRNA-染色质交叉对话在与ASD相关的囊泡运输通路中起作用。此外，RPS10P2-AS1在ASD颞叶皮层中表达升高。该lncRNA在人神经祖细胞中过表达时，被证明能调节神经发育基因集的表达。这些发现将lncRNA功能锚定在转录因子结合、增强子占据和染色质重塑因子相互作用上，这些相互作用进而传播到神经发育基因网络。

某些ASD相关的lncRNAs通过ceRNA机制抑制miRNAs。外泌体IFNG-AS1通过吸附miR-21a-3p并调节Akt信号通路而作为ceRNA发挥作用。通过干细胞来源的外泌体递送IFNG-AS1可改善BTBR小鼠的神经发生和ASD样行为。MIR600HG是一个在ASD共表达模块中下调的lncRNA，它参与了一个ceRNA网络，与ASD易感miRNAs相互作用以调节突触基因。这些例子说明了几种ASD相关的lncRNAs通过ceRNA竞争机制运作。

虽然确切机制尚未明确，但一些研究表明ASD相关的lncRNAs也调节剪接过程。影响PTCHD1-AS的微缺失损害了人神经元中的兴奋性传递，降低了AMPA受体介导的微型兴奋性突触后电流的频率和幅度。研究表明，PTCHD1-AS外显子3的缺失导致PTCHD1-AS剪接的改变，从而影响正常的兴奋性突触功能。COSMOC在神经干细胞中表达，并在神经元分化过程中上调，在源自ASD患者的嗅球干细胞中敲低该lncRNA会扰乱脂质代谢、DNA调控和氧化还原稳态的基因程序。该lncRNA通过抑制剪接调节因子PTBP2来调节神经元基因的剪接。这些研究显示了ASD相关的lncRNAs对剪接过程的调控，这反过来又影响了ASD中神经元基因的表达。

总之，机制研究揭示，尽管ASD相关的lncRNAs在基因组上具有多样性，但它们汇聚于一组核心的调控过程。这些过程包括反义调控、转录基因调控、通过ceRNA机制进行调控以及剪接过程的调控。因此，以lncRNA为重点的研究为理解ASD的分子基础提供了一个框架，并突出了新型靶向lncRNAs的治疗干预潜力。这些关键的lncRNAs成为连接遗传和环境信号与突触功能及行为的切入点。

环状RNA在自闭症谱系障碍中的功能和机制

CircRNAs是一类具有共价闭合环状结构的非编码RNA。这些分子在体内比其线性对应物表现出更高的稳定性，并通过称为反向剪接的过程产生。在细胞核内，circRNAs参与转录调控。在细胞质中，许多circRNAs作为miRNA海绵或结合RNA结合蛋白，从而影响mRNA翻译和蛋白质复合物形成。近期研究开始探讨circRNAs在ASD中的作用。本节将分三类介绍circRNAs的研究：使用动物模型的研究、涉及人类样本和细胞的研究，以及关于circRNAs作为生物标志物潜在用途的调查。

一项研究旨在鉴定和分析BTBR小鼠模型海马体中差异表达的circRNAs。对海马组织进行RNA测序，识别出数千个候选circRNAs，其中许多在BTBR小鼠与野生型对照相比表现出显著调节。研究人员验证了几个受BTBR调节的circRNAs，包括一个源自Cdh9基因的circRNA（circCdh9）。跨多个脑区表征了circCdh9的表达；对BTBR海马的进一步分析揭示了与ASD发病机制相关的生物学和分子通路的破坏。这些发现表明，海马circRNA表达的改变对ASD有所贡献。

另一项研究检查了丙戊酸诱导的自闭症小鼠模型中的circRNA表达谱。分析识别出 autism 组中1059个失调的circRNAs，其中477个上调，582个下调。验证了其中两个circRNAs：novel_circ_015779 和 novel_circ_035247。进行了生物信息学分析以预测这些circRNAs与miRNAs之间的相互作用，从而构建了一个自闭症相关的ceRNA网络。该网络包含1059个circRNAs、1926个miRNAs和6730个mRNAs，突显了ASD中circRNA介导的基因调控的复杂性。该研究还检查了已识别circRNAs的潜在功能和机制。基因本体论和京都基因与基因组百科全书通路富集分析显示，ceRNA网络内的circRNAs与涉及突触功能、神经发育和免疫反应的信号通路相关。作者提出这些发现可以为ASD发病机制和潜在治疗靶点提供见解。

最近一项研究调查了circRNAs在由暴露于PM_2.5（一种与ASD风险相关的环境污染物）诱导的ASD大鼠模型中的作用。转录组测序识别出对照组和PM_2.5暴露大鼠之间circRNA表达的显著差异。总共检测到7770个circRNAs；其中18个表现出差异表达。在验证了10个circRNAs的表达后，研究人员确定这些差异表达的circRNAs主要富集在与胎盘发育和繁殖相关的通路中。生物信息学分析预测，两个circRNAs——circ-Mbd5 和 circ-Ash1l——可能调控与ASD相关的基因网络。这些发现表明，PM_2.5暴露通过改变circRNA表达和下游基因调控来促进ASD发展。

另一项研究考察了基于草甘膦的除草剂暴露与小鼠ASD样表型之间的联系。研究结果表明，母体暴露于基于草甘膦的除草剂会改变后代肠道微生物群组成和代谢物水平，导致前额叶皮层中circRNA表达的改变。这些结果通过肠-脑轴的破坏，突显了circRNAs在ASD发病机制中的潜在作用。

在人类中，大多数ASD相关研究测量了脑样本中的circRNA表达。一项研究使用来自健康对照和ASD个体的近200个人脑样本分析了circRNA表达模式。识别出数百个新的circRNAs，并且发现circRNA表达并非随机的。研究人员观察到，个体间circRNA表达的变异性不如大脑皮层和小脑之间的变异性显著。此外，识别出一个在ASD样本中上调的circRNA共表达模块，强调了自闭症大脑中发生的复杂转录组改变。这些发现提供了一个全面的circRNAs目录以及对其在人脑中表达的见解。

另一项研究对来自ASD患者和非ASD对照的死后脑样本进行了全基因组circRNA表达谱分析。分析识别出60个在ASD中受到干扰的circRNAs和三个共调控模块。通过将这些数据与来自相同皮层样本的miRNA和mRNA失调数据集整合，研究人员构建了一个ASD相关的circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络。这些相互作用的目标基因显著富集了ASD风险基因，特别是高置信度的ASD相关基因，但并未富集与其他脑部疾病单基因形式相关的基因。该研究聚焦于circRNA-miRNA-mRNA调控相互作用，并显示circARID1A在ASD中显著上调。实验验证确认了circARID1A的反向剪接连接点，该circRNA含有多个miR-204-3p的结合位点，而miR-204-3p是一个在ASD中下调的miRNA。在人神经元细胞系中的功能测定证明，circARID1A作为miR-204-3p的海绵，暗示了一种 underlying ASD相关基因表达变化的调控机制。

最近一项研究调查了circQTLs，它们调控附近circRNAs和远端基因（trans-eGenes）在ASD中的表达。研究人员确定circQTLs有助于circRNA的形成，并且比非circQTLs更可能作为反式表达数量性状位点（trans-eQTLs）发挥作用。研究结果表明，一些circQTLs通过调节附近的circRNAs来间接调控远端基因的表达。该研究识别出352条circQTL-circRNA-trans-eGene-ASD诊断传播路径，这可能解释circQTLs与ASD之间的关联。参与这些通路的基因富集了先前识别的ASD相关基因，支持了它们与ASD病理生理学的相关性。此外，识别出12条circQTL-circRNA-miRNA-trans-eGene-ASD诊断传播路径，提供了遗传变异与ASD相关性状之间的潜在因果联系。这项研究建立了一个调查circQTLs反式遗传效应及其在疾病中因果关系的框架，该框架可应用于其他复杂疾病。

另一项研究聚焦于ASD儿童外周血中的外泌体miRNAs。通过RNA测序，研究人员识别出ASD患者中差异表达的mRNAs、miRNAs和circRNAs。随后他们构建了ceRNA调控网络，并观察到LGI1（一个与ASD相关的基因）的表达水平与CD8⁺ T细胞的丰度之间存在显著正相关。这些发现暗示了外泌体miRNAs和ceRNA网络在ASD相关的免疫失调中的作用。

总之，越来越多的证据表明circRNAs可能在ASD发病机制中扮演关键角色。需要进一步研究以充分阐明circRNAs在ASD中的功能和机制，这可能有助于开发新的诊断和治疗策略。

结论

过去十年中，大量研究强调了lncRNAs和circRNAs在ASD发病机制中的关键作用。非编码区域内的变异——特别是那些影响lncRNAs的变异——似乎会破坏神经元发育、突触功能和免疫反应。实验结果表明，ASD患者样本中失调的lncRNA表达影响神经突生长、染色质重塑和细胞死亡，强化了lncRNAs在ASD病理生理学中的核心作用。此外，circRNAs已成为ASD相关基因网络的关键调节因子，主要通过其结合和隔离miRNAs的能力。涉及动物模型和人类死后样本的分析已识别出与ASD密切相关的独特circRNA表达模式，表明它们在诊断和治疗中的实用性。

解释非编码变异的一个关键挑战是区分致病驱动因素与代偿反应。未来的研究应通过采用等位基因特异性扰动、时间和剂量反应设计、整合性遗传分析、单细胞多组学和体内验证来确立方向性和机制。应用明确的因果关系标准——例如时间优先性、跨模型效应方向的一致性以及跨独立数据集的收敛性——将有助于确定观察到的变化是致病性的还是适应性的。围绕这些原则构建未来的工作，将澄清哪些lncRNA和circRNA信号代表了可操作的疾病机制，而非代偿性重塑，从而锐化生物标志物的开发并为ASD中的治疗靶向提供信息。