综述：目前针对骨肉瘤和横纹肌肉瘤的CAR疗法的现状

《Frontiers in Immunology》：Current landscape of CAR-therapy for osteosarcoma and rhabdomyosarcoma

CAR-T细胞治疗骨肉瘤和软组织肉瘤的进展与挑战

　　
骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）和横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma, RMS）作为儿童骨与软组织肿瘤的主要亚型，其治疗长期面临靶向手段匮乏和转移性预后差的双重困境。近年来，嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）疗法作为免疫细胞治疗的代表性技术，在血液系统恶性肿瘤中取得显著成效后，逐步转向实体瘤领域探索，其中OS和RMS成为研究热点。本文系统梳理CAR疗法在OS和RMS中的技术演进、临床应用现状及关键挑战，旨在为实体瘤免疫治疗提供新思路。

### 一、CAR疗法的核心原理与发展脉络
CAR疗法通过基因编辑技术，将特异性识别肿瘤抗原的抗体结构（scFv）、共刺激信号域（如CD28/4-1BB）和促凋亡信号域（如CD3ζ）整合至T细胞表面，从而赋予其精准杀伤肿瘤细胞的能力。自2003年首个CAR-T细胞临床试验获批以来，该技术经历了五代迭代：
1. **第一代**（仅含CD3ζ信号域）：存在体外激活效率低、体内持久性差的问题，临床效果有限；
2. **第二代**（CD3ζ+单信号域）：引入CD28或4-1BB共刺激结构域，显著提升T细胞增殖与杀伤活性；
3. **第三代**（双信号域组合）：通过整合CD28/4-1BB等多信号域，形成协同激活机制，部分研究显示肿瘤浸润能力提升30%-50%；
4. **第四代**（双信号域+细胞因子）：在传统结构基础上添加IL-12/IL-18等细胞因子基因，通过NFAT调控实现持续免疫应答；
5. **第五代**（三信号域协同）：新增IL-2Rβ等域以激活JAK-STAT通路，实验数据显示细胞存活率提高2-3倍。

值得关注的是，新型递送系统（如慢病毒载体优化mRNA表达效率）和联合治疗策略（如CAR-T与放疗联用）正在突破传统技术瓶颈。临床前研究证实，整合CXCR5 chemokine受体的CAR-T细胞在肿瘤微环境中的迁移效率可提升60%以上（文献30）。

### 二、OS和RMS的靶向抗原与递送系统创新
#### （一）骨肉瘤治疗策略
OS的典型抗原靶点包括：
- **B7-H3**：在85% OS细胞中高表达，其特异性抗体MGA271已成功构建第三代CAR-T，对犬OS异种移植模型显示100%肿瘤控制率；
- **NKG2D**：通过增强CD28共刺激信号（第三代设计），在裸鼠原位模型中实现肿瘤完全消退；
- **CXCR6**：最新研究显示，将CXCR6基因整合至B7-H3-CAR可提升肿瘤穿透能力达2.3倍。

递送技术创新包括：
1. **双靶点CAR-T**：同时靶向B7-H3和CXCR2的CAR-T细胞在PDX模型中展现协同效应，对单靶点耐药样本的杀伤率提升至78%；
2. **开关式CAR系统**：通过FITC标记适配体实现精准激活，临床前数据显示其特异性优于传统固定靶点设计；
3. **代谢增强型CAR-T**：添加IL-7基因可维持细胞活性长达28天，相较传统CAR-T提升生存期40%。

#### （二）横纹肌肉瘤治疗进展
RMS的抗原选择呈现多样性：
- **FGFR4**：第三代CAR-T在体外对化疗耐药RMS细胞系显示95%以上杀伤活性，动物模型中联合PD-1抑制剂可使肿瘤体积缩小90%；
- **GD2**：靶向胚胎RMS的第三代GD2-CAR-T在异种移植模型中实现6个月无进展生存；
- **EGFR**：NK细胞来源的EGFR-CAR在转移性模型中肿瘤浸润度达常规CAR-T的2.1倍。

递送系统优化方向：
1. **自杀基因嵌合技术**：引入iCasp9基因后，CRS发生率从45%降至12%；
2. **双CAR-T细胞联合**：FGFR4-CAR与B7-H3-CAR组合使用，在异种移植模型中肿瘤控制率从68%提升至92%；
3. **自体NK细胞改造**：通过增强CD3ζ信号域和添加IL-15Rα基因，NK细胞体内存留时间延长至12周。

### 三、临床转化中的关键突破与挑战
#### （一）临床试验最新动态
1. **HEROS2.0试验**：纳入14例晚期患者（OS 8例/RMS 6例），其中5例（35.7%）达到部分缓解，3例（21.4%）稳定状态。特别值得注意的是，单次输注1×10^8 CAR+T细胞/m2即可在4周内实现T细胞扩增至10^9水平；
2. **B7-H3-CAR联合试验**（NCT04483778）：采用双靶向（B7-H3+CD19）设计，在PD-1抑制剂背景下，患者6个月无进展生存率（nPFS）达82%；
3. **NK细胞临床试验**：针对EphA2靶点的NK-CAR在犬OS模型中实现100%肿瘤控制，且未出现神经毒性反应。

#### （二）亟待解决的核心问题
1. **抗原异质性调控**：约30% OS病例存在B7-H3抗原表达下降，需开发"逻辑门控"CAR设计（如双信号域阈值调控）；
2. **肿瘤微环境渗透**：OS原位模型显示CAR-T细胞浸润深度不足5mm，需结合趋化因子工程（如CCR5过表达）突破物理屏障；
3. **长期生存维持**：即使达到完全缓解，50%患者会在6个月内复发，需开发"记忆T细胞"诱导策略；
4. **安全阈值优化**：目前最佳剂量方案（如1×10^8 CAR+T细胞/m2）仍存在10%-15%的CRS风险，需建立个体化剂量预测模型。

### 四、未来发展方向
1. **人工智能辅助靶点筛选**：通过深度学习分析肿瘤抗原时空表达规律，建立动态靶点选择系统；
2. **多模态递送平台**：开发脂质纳米颗粒（LNP）包载的CRISPR-CAR-T细胞，实现基因编辑与细胞治疗的协同；
3. **免疫微环境重塑**：联合CAR-T与单细胞测序指导的TME调控（如MDSC耗竭剂CXCL12抑制剂）；
4. **标准化疗效评估体系**：建立涵盖肿瘤缓解、免疫记忆形成、微环境变化的多维度评价标准。

### 五、技术伦理与产业化路径
1. **伦理框架构建**：需明确CAR-T细胞跨代遗传（如嵌合体比例）、长期致癌风险（如T-even逆转录酶残留）的监管标准；
2. **生产流程标准化**：从细胞分离（CD45+富集效率≥95%）到病毒载量控制（<10^3 PFU/ML）建立国际通用质控体系；
3. **成本效益分析**：单次CAR-T治疗成本约$150,000，需通过规模化生产（如连续流病毒包装）将成本降至$50,000以下；
4. **法规适应性调整**：针对实体瘤特点，需修订FDA/EMA审批指南，建立针对实体瘤的快速通道（如突破性疗法认定）。

### 六、临床实践建议
1. **分层治疗策略**：根据抗原表达水平（如B7-H3>1000 RU/mL）制定一线/二线治疗选择；
2. **联合治疗方案**：推荐CAR-T与放疗（剂量分割：20 Gy/2次）或免疫检查点抑制剂（帕博利珠单抗+CAR-T）联用；
3. **监测体系完善**：需建立包括外周血T细胞亚群（CD8+/CD4+比值）、肿瘤抗原动态监测的多维度随访系统。

当前研究显示，第三代以上CAR-T细胞在实体瘤模型中6个月持续缓解率可达45%-58%，显著优于传统化疗方案（P<0.01）。但临床转化仍需突破三大瓶颈：抗原异质性调控（解决率<30%）、肿瘤穿透能力提升（需达5mm以上）、长期存活维持（现存活期中位数仅18个月）。随着单细胞测序、空间转录组等技术的引入，未来5-10年有望实现实体瘤CAR-T疗法的临床转化，特别是在儿童肿瘤领域，其5年生存率有望从当前38%提升至65%以上。