《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Expanding the CRISPR/Cas toolkit: applications in proteomics and theranostics
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传统的基因组编辑方法存在非特异性、劳动密集型且耗时的缺陷。在此背景下，CRISPR/Cas技术代表了一项重大突破。该技术源于由成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Rep
传统的基因组编辑方法存在非特异性、劳动密集型且耗时的缺陷。在此背景下，CRISPR/Cas技术代表了一项重大突破。该技术源于由成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR）与RNA引导的DNA内切酶Cas组成的复杂微生物防御系统。除其在基因组编辑中的原始作用外，CRISPR在蛋白质组学、功能基因组学和分子治疗领域持续发挥重要作用。动物模型（包括小鼠、果蝇、斑马鱼等）通过反向遗传学方法（如敲入、敲除、CRISPR干扰及插入/缺失突变策略）利用CRISPR技术揭示蛋白质功能，已获益显著。在临床前沿，CRISPR基因治疗亦取得成效，应用于镰状细胞病、高胆固醇血症及癌症免疫治疗等领域。然而，显著挑战依然存在，包括体内包装与递送效率、毒性及基因组脱靶效应。当前克服这些问题的努力包括开发新型递送制剂（如纳米颗粒、外泌体）、人工智能引导的实验设计及Cas蛋白的小型化。本综述聚焦于CRISPR/Cas基因编辑机制，并探讨其在蛋白质组学与诊疗一体化（theranostics）领域的最新应用。
1 引言
基因组编辑长期以来是分子生物学、医学和生物技术的目标，其历史可追溯至限制性内切酶的发现。锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）及近期采用的CRISPR/Cas系统推动了基因组编辑时代的发展。这些工具可精确切割DNA序列，诱发靶序列的双链断裂（DSB），随后通过易错的非同源末端连接（NHEJ）或精确的同源定向修复（HDR）机制修复损伤，导致靶区域插入/缺失（indel）及置换。CRISPR相较传统编辑器具有多重优势：靶标设计简便、脱靶位点可预测及多基因组位点同时修饰（多重编辑）能力。CRISPR-Cas系统的两个核心组件为向导RNA（gRNA）与CRISPR相关Cas蛋白。gRNA为约20核苷酸长的基因特异性序列；Cas-gRNA复合物结合至原型间隔序列邻近基序（PAM）附近的DNA，gRNA引导Cas核酸酶在靶序列产生双链切割，经NHEJ修复后引入indel。除广泛使用的化脓链球菌SpCas9外，新兴CRISPR/Cas系统如SpCas9-NG、碱基编辑器、xCas9、Cas12a、Cas13及Cas14亦日益普及。此外，Cas9切口酶（nickase）作为Cas9突变体，在gRNA靶位点产生单链断裂而非野生型Cas酶介导的双链DNA断裂；利用DNA互补链上的双切口策略可降低脱靶效应。凭借其多功能性与稳健性，CRISPR已成为复杂生物模型系统开发、蛋白质组学及诊疗一体化（结合治疗与诊断）不可或缺的工具。在蛋白质组学领域，CRISPR实现了蛋白质相互作用伙伴鉴定、蛋白质相互作用相关基因座定位、蛋白质亚细胞定位及下游蛋白质组细胞模型开发。在临床及诊疗一体化方面，CRISPR被广泛用于纠正有害碱基突变、通过工程化基因敲除破坏致病基因，以及插入点突变以评估其功能重要性。然而，快速进展因CRISPR机制固有挑战而受限：首先，依赖单一gRNA结合的CRISPR/Cas系统全基因组脱靶效应仍是主要关注点；其次，易错修复途径依赖导致异质性突变谱；第三，细菌Cas蛋白及腺相关病毒（AAV）等递送系统的免疫原性；第四，Cas变体尺寸过大限制其高效递送。工程化紧凑Cas变体、非病毒递送系统及AI辅助向导设计正用于应对这些挑战。现有CRISPR综述常窄化专精，缺乏连接蛋白质组学、诊断与治疗自然关联领域的综合整合。本综述总结CRISPR基因编辑机制，讨论其在上述领域的技术进展，并强调当前挑战与缓解策略。
2 CRISPR/Cas基因组编辑机制
CRISPR/Cas9基因组编辑机制简要分为三个步骤：识别、切割与修复。Cas9核酸酶特异性由单链向导RNA（sgRNA）中约20 nt向导序列决定。sgRNA通过其与crRNA（sgRNA内靶特异性序列）的5′互补碱基配对引导Cas9至感兴趣基因靶序列。常规使用的化脓链球菌Cas9识别5′-NGG-3′ PAM序列，并于PAM上游3 bp处切割DNA。Cas9包含两个核酸酶结构域——HNH结构域切割靶DNA互补链，RuvC结构域切割非互补链，共同产生平末端双链断裂（DSB）。靶位点DSB激活细胞DNA修复，导致两类基因组修饰：经NHEJ的组成性敲除（KO）及经HDR的敲入（KI）。
2.1 CRISPR/Cas递送系统
Cas9与sgRNA可作为DNA、mRNA或核糖核蛋白递送。组织培养中常包装于单一嵌合SpCas9-gRNA质粒（如PX330）。体内基因治疗依赖病毒或非病毒递送系统包装这些组件，包括AAV（包装容量<5 kb）、慢病毒（约10 kb但基因组整合倾向高）及共封装Cas9 mRNA与sgRNA的脂质纳米颗粒（LNP）等纳米载体。为规避病毒方法的载荷限制、免疫原性与毒性，非病毒递送系统如纳米颗粒（NP）得以开发，其优势包括非基因组整合导致的显著低脱靶效应、完全合成性质决定的低免疫原性。NP递送可调控为pH、光、氧化还原或磁敏感，实现细胞微环境精准靶向。其他纳米载体亦被探索，如有机（PEG、PEI、壳聚糖）与无机NP（金、二氧化硅）及DNA折纸纳米结构。交联无机纳米颗粒可工程化吸附表面 cargo（包括ssDNA供体与Cas9）并最小化毒性；DNA折纸纳米结构作为自组装微管内化Cas9/sgRNA，具有高生物相容性。杂化策略如LNP-SNA（脂质纳米颗粒-球形核酸）显著改善LNP功效与生物相容性。LNP功效受肝内组织限制，因其内吞途径、有限生物分布及低内体逃逸（即内溶酶体降解倾向）。总体而言，可调杂化纳米平台在CRISPR组件递送中日益普及。最近，AI引导的新型NP制剂设计、动力学与生物相容性预测已具雏形，虽其CRISPR与基因治疗特定应用仍待探索。
2.2 CRISPR/Cas介导的基因敲除
利用NHEJ修复易错特性，研究人员广泛用于功能基因组学、反向遗传学、疾病建模及药物发现小分子筛选中的基因功能缺失研究。单gRNA在基因编码序列引入移码突变常导致提前终止密码子（PTC），产生截断无功能蛋白；含PTC的mRNA通常被无义介导的mRNA衰变（NMD）识别降解，这可能通过“转录适应（TA）”激活遗传补偿或聚合 rescue 表型。此现象可通过双gRNA靶向基因座侧翼序列或删除基因启动子序列规避，阻止截断mRNA形成，有效绕过NMD。
2.3 位点定向敲入 using CRISPR/Cas
Cas9诱导DSB可触发HDR，促进精确基因敲入。需引入供体模板，由所需序列侧翼对应于切割处两侧同源区组成。供体模板可为小（<200 nt）单链寡脱氧核苷酸（ssODN）、单链DNA（ssDNA，可达1 kb）及双链DNA（dsDNA，>1 kb）。基因敲入较敲除更具挑战性，因HDR发生率低于NHEJ、供体尺寸限制及大模板潜在脱靶整合。补救方法为含ss悬突dsDNA模板（odsDNA）在较大插入中显示前景。CRISPR敲入已成功用于多种模式生物。近年，CRISPR/Cas9介导敲入技术在斑马鱼研究中广泛应用以生成人类疾病模型及插入荧光报告子研究内源基因表达。HDR效率受供体片段可用性、类型、结构与长度影响；5′端修饰（如5′AmC6或5′AmC12）供体增强跨细胞类型与模式生物敲入效率；近期5′生物素化dsDNA供体与NHEJ抑制结合最小化脱靶整合并提升HDR介导插入精度。
3 CRISPR/Cas系统应用
作为强大多重基因组编辑技术，CRISPR广泛实现精确基因改变与功能研究。多种遗传修饰生物已生成以阐明基因功能、蛋白质相互作用、亚细胞定位及疾病相关信号通路。CRISPR亦应用于诊疗一体化，包括诊断、基因组编辑、基因治疗、药物发现及表观基因组编辑。蛋白质组学进展使CRISPR基诊断与治疗成为可能，如泛癌蛋白质基因组学方法利用整合CRISPR数据集发现可成药靶点；系统性红斑狼疮（SLE）中CRISPR激活miR-146a筛选鉴定SLE连锁功能增强子，铺就治疗靶向之路。
3.1 CRISPR在蛋白质组学
蛋白质组学发展显著受基因组编辑技术助力。CRISPR/Cas在蛋白质组学应用分三类：蛋白质-蛋白质相互作用研究、蛋白质-染色质相互作用研究及生物模型开发。CRISPR-Cas常作为桥梁连接现有技术以探究这些相互作用；生物模型开发则需快速高效基因编辑研究内源水平基因功能。
3.1.1 蛋白质-蛋白质相互作用
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）是所有生物体调节细胞功能与信号通路的本质过程。CRISPR作为强大工具通过内源标记靶蛋白简化相互作用组无偏绘图。稳定同位素标记细胞培养（SILAC）与多维蛋白质鉴定技术（MudPIT）比较AMPKα2亚基相互作用组；生物素鉴定（BioID）与CRISPR-Cas9检查刚地弓形虫必需蛋白相互作用组；SPEAC-seq技术无需先验知识直接鉴定细胞间串扰调节因子。CRISPR广泛用于引入靶向点突变以破坏/修饰相互作用结构域，亦可创建融合蛋白揭示时空相互作用。荧光标签CRISPR敲入策略实现实时相互作用观察与亚细胞定位信息获取，如OpenCell数据集内源标记1311个人蛋白；内源CRISPR标记细胞器进行蛋白质组聚类分析揭示相关细胞器共功能蛋白。
3.1.2 蛋白质-染色质相互作用
蛋白质-染色质相互作用（PCI）依赖组蛋白、转录因子及染色质重塑因子修饰染色质形状与功能。核酸酶死亡Cas9（dCas9）结合靶DNA但不切断，可融合转录激活子、抑制子或表观修饰域用于染色质成像、靶向表观编辑及转录控制。工程DNA结合分子介导染色质免疫沉淀（enChIP）联合质谱鉴定PCI；Cas9基因座相关蛋白质组（CLASP）策略快速适配任何基因座；CRISPR-ChAP-MS、CAPTURE等方法亦用于此。邻近标记如CasID、C-BERST、CAPLOCUS鉴定特定基因组位点蛋白组成。CRISPR靶向DNA甲基化编辑（CRISPR-TDM）与CRISPR靶向组蛋白修饰编辑（CRISPR-THME）精确操纵表观遗传标记。
3.2 生物模型开发
精确模拟体内环境的生物模型对理解细胞功能与疾病机制至关重要。CRISPR方法实现特定基因与通路精确有效操控，变革细胞模型构建。功能缺失实验为基因功能初始评价范式；创建靶基因缺失细胞系可广泛考察表型关系。质谱分析PrP敲除NMuMG上皮细胞表型影响；CRISPR抑制与定量质谱探索大肠杆菌代谢；CRISPRi筛查结合定量质谱研究关键酶下调抵消机制；CRISPR KO鉴定亨廷顿病CAG重复扩增修饰候选基因。增益功能特异突变模型亦易用蛋白质组学研究，如引入EGFR C797S突变比较差异蛋白质组与转录组；CRISPR-Cas碱基编辑器与定量质谱结合表明腺嘌呤碱基编辑较HDR法效率高且脱靶低。
3.3 CRISPR在诊疗一体化
诊疗一体化结合诊断与治疗个性化疾病处理。CRISPR基诊断工具高灵敏检测患者样本病毒感染；个性化基因治疗靶向患者特异基因组改变。
3.3.1 诊断
CRISPR/Cas使科学家开发精确高效遗传突变与疾病检测方法。Cas9编程靶向 altered DNA序列，突变导致sgRNA引导切割产生可检测信号，加速癌症 biomarker 检测（如microRNA表达偏移、疾病特异点突变、病毒DNA）。CRISPR基生物传感器串联检测多重 biomarker。Cas13核酶等温预扩增识别病毒ssRNA，激活切割荧光报告基因发光。CARMEN平台鉴定病原体感染；单细胞CRISPR策略追踪癌基因sgRNA插入克隆扩增揭示肿瘤坏死因子通路驱动皮肤癌发生。DETECTR平台利用CRISPR/Cas12a识别HPV感染，结合等温扩增达阿摩尔灵敏度。
3.3.2 CRISPR/Cas9基成像
CRISPR成像使用修饰融合荧光蛋白Cas9可视化活细胞特异DNA序列。CASFISH技术靶向结合DNA触发荧光蛋白招募显微镜可视；Pepper稳定自降解荧光蛋白-sgRNA实现高对比亚细胞基因组位点亮相；多色成像与PET组合亦已开发。
3.3.3 药物发现
CRISPR在药物开发生命周期两关键步骤举足轻重：可成药靶点鉴定与耐药细胞驱动因子识别。全基因组CRISPR筛查发现BRD4为癌症治疗潜力靶点催生BET抑制剂；DrugTargetSeqR系统HDR敲入野生/突变序列筛查药物抵抗；碱基编辑器筛查揭示候选蛋白亚结构域调控元素。
3.3.4 遗传疾病治疗
CRISPR/Cas9潜力通过纠正根本遗传突变治疗遗传病。
3.3.4.1 哺乳动物细胞基因组编辑
直接编辑DNA校正突变：HDR恢复CYBB基因ROS活性；碱基删除治疗白内障；修复杜氏肌营养不良iPSC dystrophin；CXCR4/CCR5编辑防HIV感染。CAR-T疗法中dCas9-Clo051核酸酶（Cas-CLOVER）减脱靶增效；碱基编辑器CD45表位单取代使CAR-T选择性抗性治疗白血病淋巴瘤。
3.3.4.2 基因治疗
体内基因治疗进展迅速：小鼠心脏CaMKIIδ氧化敏感残基编辑护心；视网膜色素变性等建模成功。递送系统同步监测给药，如光诱导系统、金纳米团簇-Cas9-gRNA共轭。临床转化包括镰状细胞病BCL11A编辑重表达胎儿血红蛋白获FDA批准；新生儿氨甲酰磷酸合成酶1缺乏碱基编辑治疗；囊性纤维化、亨廷顿病等探索。需注意高剂量AAV包装CRISPR致免疫应答风险。
3.3.4.3 表观遗传编辑
dCas9作为DNA结合平台靶向融合表观修饰酶改变特异区域表观状态。p300乙酰转移酶融合dCas9乙酰化H3K27激活转录；DNMT3L/3A-KRAB融合全表观编辑；破坏UHRF1重新激活胎儿珠蛋白；化学可编程CRISPR表观编辑器招募JQ1沉默c-MYC致癌基因。
4 挑战与缓解策略
CRISPR/Cas治疗人类遗传病前景伴随递送效率、脱靶、免疫原性挑战。适体改善Cas9特异性调节功能；Cas小型化（Cas12f、Cas12j2、Cas9d、Cas13）克服尺寸障碍；先进纳米平台（RNP-LNP、LNP-SNA、脂质包覆无机NP等）改善体内稳定性与内体逃逸。脱靶缓解用Cas9 nickase及抗CRISPR蛋白；大模型训练工程Cas9（OpenCRISPR-1）减脱靶95%；AI工具（CRISPRon、DeepCRISPR、TIGER等）增靶向效。免疫原性应对包括免疫缺陷器官使用、产前给药、免疫静默Cas9及正交 orthologue。HDR效率偏倚可用RS-1或小分子增强。伦理与监管涉及种系编辑、知情同意与公平获取。
5 结论与未来展望
CRISPR变革遗传学及功能基因组学，并延伸至蛋白质组学与诊疗一体化。未来：开发CRISPR基靶向蛋白降解工具及修饰蛋白稳定性/酶活性用于治疗；新型诊断方法识别蛋白 biomarker；人类治疗基因疗法修复缺陷基因；CRISPR集成蛋白质组学（邻近标记、靶向蛋白扰动绘制网络）；诊疗一体化纳米平台共递送编辑器与影像探针临床转化；AI、纳米技术及单细胞组学汇聚加速精准工程与患者特异诊疗。
Acknowledgements
