以Adhiron为模板指导抗病毒小分子配体发现的创新策略

《Communications Biology》：Adhirons are efficient tools to guide antiviral ligand discovery

本文推荐一项抗病毒药物发现新策略。研究人员针对克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)和甲型流感病毒(IAV)，开发了基于Adhiron蛋白的配体导向虚拟筛选方法。研究成功获得可结合病毒靶点蛋白并抑制病毒复制的先导化合物，为抗体模拟物开发提供了新范式。

　　

在病毒肆虐的当今世界，SARS-CoV-2大流行让我们深刻认识到病毒性疾病对全球健康的威胁。虽然疫苗是预防病毒感染的有效手段，但抗病毒药物对于治疗重症病例同样至关重要。然而，新药研发通常需要耗费十余年时间，这一漫长过程难以应对突发疫情。为了加速药物开发进程，科学家们不断探索新的方法策略。

抗体药物能够高效靶向特定蛋白并中和病毒感染，但其应用受到药代动力学特性不佳和组织渗透性差的限制。一种前景广阔的策略是开发模拟中和抗体功能的小分子化合物。尽管已有成功案例，如基于单克隆抗体结合区域开发的环状有机小分子，但抗体的大分子结合界面意味着其他生物制药可能更适合作为小分子开发的模板。

在这项发表于《Communications Biology》的研究中，Alex J. Flynn等研究人员开发了一种创新策略，利用Adhirons（也称为Affimers）作为模板来指导抗病毒小分子配体的发现。Adhirons是基于植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂共识序列人工设计的小型抗体样蛋白，具有高热稳定性、易于大肠杆菌表达纯化等优点。更重要的是，其分子量仅约12 kDa，远小于抗体，且能结合靶蛋白表面的较小口袋，这使它们成为理想的小分子开发模板。

研究团队聚焦于两种重要病毒：克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)和甲型流感病毒(IAV)。CCHFV是唯一在欧洲流行的生物安全四级(BSL4)病毒，致死率达5-30%，而目前治疗选择有限。IAV则每年导致全球30-50万人死亡，且不断出现的耐药株威胁着现有药物的有效性。

研究人员开发了一套完整的工作流程，将Adhirons、商业化合物库和结构方法相结合，以加速病毒小分子抑制剂的发现。他们首先利用已有高分辨率晶体结构的CCHFV核蛋白(NP)特异性Adhiron（NP-Adhiron）作为模板，通过结构分析确定其结合关键区域，然后进行配体基虚拟筛选。对于缺乏高分辨率结构信息的IAV血凝素(HA)特异性Adhiron（A5），则采用同源建模预测其结构后再进行虚拟筛选。

关键技术方法包括：基于结构的分子相互作用分析（PDBePISA）、配体基虚拟筛选（ROCS和EON）、分子对接（Glide SP）、分子动力学模拟（Desmond）、细胞毒性检测（ATPlite法）、病毒复制抑制实验（迷你基因组系统和TCID₅₀测定）、蛋白-配体结合分析（纳米差示扫描荧光技术和¹⁹F NMR弛豫测量）等。

结果

小分子模拟物可利用Adhiron与靶标结合的结构信息进行鉴定

研究人员首先分析了CCHFV NP与NP-Adhiron的复合物晶体结构（PDB: 6ZOO），以确定Adhiron中与靶标结合的关键区域。分析发现，NP-Adhiron的第二个环（loop 2）是结合的主要决定因素，其中残基106-110（DFWKD）形成了与CCHFV NP的核心相互作用位点。该区域结合涉及疏水效应和极性相互作用等多种化学作用力。

研究人员将该五肽（DFWKD）从三维结构中提取出来，作为配体基虚拟筛选的模板。他们使用ROCS程序在eMolecules数据库中筛选形状相似的化合物，然后通过EON评估静电相似性。经过视觉检查和基于结构多样性的优先选择，最终获得了7个商业可用的小分子化合物（AF1-01至AF1-07）。这些化合物仅模拟了部分而非全部关键结合相互作用，因此预计其结合亲和力会低于模板Adhiron。

CCHFV NP Adhiron的小分子模拟物在迷你基因组实验中展示出病毒复制抑制能力

在体外表征中，研究人员首先在BSR-T7细胞系中评估了化合物的细胞毒性。除AF1-01和AF1-02显示约70%细胞存活率外，其余化合物在10μM浓度下均无明显毒性。随后，利用CCHFV迷你基因组系统（监测eGFP报告基因表达）评估化合物的抑制活性。结果显示，AF1-02在10μM浓度下能将GFP荧光降低至约50%，且降低幅度大于其在细胞毒性实验中对存活率的影响，表明该化合物能特异性抑制CCHFV复制。

CCHFV NP Adhiron的小分子模拟物与NP结合

通过纳米差示扫描荧光(nanoDSF)技术检测化合物与CCHFV NP的结合情况。nanoDSF通过测量蛋白质内在荧光（色氨酸荧光波长随蛋白质展开从330 nm移至350 nm）的变化来检测配体结合引起的蛋白质热稳定性改变。结果显示，AF1-02和AF1-05分别使CCHFV NP的熔解温度(T_m)正向偏移0.98°C和0.57°C，表明它们能与CCHFV NP结合。结合迷你基因组系统实验结果，表明AF1-02既能结合又能抑制CCHFV NP，而AF1-05虽能结合但无生物活性。

无需Adhiron-靶标结合结构信息也可鉴定Adhiron模拟物

对于缺乏高分辨率结构信息的IAV血凝素(HA)特异性Adhiron A5，研究人员首先通过同源建模（I-TASSER服务器）生成其结构模型，然后提取两个环区域作为虚拟筛选模板。通过序列比对鉴定可能参与结合的保守氨基酸，并应用与NP-Adhiron类似的筛选规则，最终获得8个模拟A5环区的小分子化合物（OA1-OA8）。

抗IAV Adhiron的小分子模拟物可结合HA并抑制组织培养中的IAV感染

在MDCK细胞中评估OA系列化合物的细胞毒性后，通过TCID_{50实验（检测化合物对病毒致细胞病变效应的抑制）评估其抗IAV活性。结果显示，化合物OA3能保护细胞免受IAV诱导的细胞死亡，IC50值为11.14μM。由于OA3干扰nanoDSF的荧光测量，研究人员采用基于配体的¹⁹F NMR CPMG实验验证其与HA的结合。结果表明，OA3与三聚体HA结合后，其¹⁹F峰的T2值降低69%，且化学位移发生变化，证实了OA3与HA的特异性结合。}

讨论与结论

本研究首次证明了Adhirons可作为开发模拟其结合区域的小分子的起始模板。针对CCHFV，基于结构的虚拟筛选发现了一个既能结合CCHFV NP又能抑制病毒复制的化合物AF1-02。针对IAV，即使在缺乏高分辨率结构信息的情况下，通过同源建模指导的虚拟筛选也发现了能结合HA并抑制病毒感染的化合物OA3。

尽管这些先导化合物的效力（OA3的IC₅₀为11.14μM）远低于其模板Adhiron（A5的IC₅₀为2.0 nM），但考虑其分子量小得多，OA3的结合效率指数(BEI)为10.2，反而高于A5的0.7，表明这些小分子是更具原子经济性的抑制剂起点。

研究还评估了多种结合测定技术，发现纳米差示扫描荧光(nanoDSF)和¹⁹F NMR是检测弱结合小分子的有效技术，受化合物干扰较小。

研究人员提出了一套从虚拟筛选到体外评估的Adhiron基小分子抑制剂鉴定工作流程。该流程的成功实施表明，Adhirons可作为开发靶向难以成药蛋白的小分子药物的有力工具，特别适用于病毒靶点。这种方法与基于肽的抑制剂开发策略形成互补，通过迭代的结构修饰有望提高效力和选择性，并优化药代动力学特性。

总之，该研究为基于 inhibitory antibody-like proteins（抑制性抗体样蛋白）的小分子模拟物鉴定提供了一套通用工作流程，为潜在治疗应用提供了新的先导化合物发现策略。随着高性能计算和大型商业化合物库的发展，这种方法有望加速针对各种病毒靶点和其他疾病领域的小分子药物发现。