基于蛋白质组范围孟德尔随机化鉴定原发性肝癌的致病血浆蛋白及靶向治疗研究

《Communications Biology》：Identification of causal plasma proteins and targeted therapy for primary hepatic carcinoma via proteome-wide Mendelian randomization

本研究针对原发性肝癌（PHC）治疗靶点匮乏的难题，通过整合816例PHC患者和631,599例对照的GWAS荟萃分析数据与两个大规模血浆蛋白质组数据集（deCODE和UK Biobank），开展蛋白质组范围孟德尔随机化（PW-MR）分析。研究鉴定出27个与PHC风险存在因果关系的循环蛋白，其中INHBC被确认为关键致病因子。机制实验表明INHBC通过激活ACVR2B-Smad2信号轴驱动肝癌进展，而临床阶段抗体Bimagrumab（ACVR2B抑制剂）在异种移植模型中显著抑制肿瘤生长（体积减少约42%, P=0.008）。该研究为PHC的精准治疗提供了新靶点。

　　

原发性肝癌（Primary Hepatic Carcinoma, PHC），主要包括肝细胞癌（HCC）和肝内胆管癌（ICC），是全球范围内一个重大的健康挑战。其发病率位居全球恶性肿瘤第六位，致死率则高居第三位。尽管已有索拉非尼、仑伐替尼等靶向药物应用于临床，但患者总体预后仍然很差，五年生存率低于20%。更严峻的是，与其他常见癌症（如肺癌、结直肠癌）相比，PHC领域缺乏有效的、可供临床选择的分子靶点，仅有不到10%的患者能够从基因型指导的靶向治疗中获益。这种治疗瓶颈凸显了深入揭示PHC发病的遗传和蛋白质组学驱动因素、并识别新的可成药靶点的迫切性。

人体血浆蛋白不仅是疾病的生物标志物，更是潜在的疾病介质和治疗靶点。近年来，高通量蛋白质组学技术的发展使得大规模分析循环蛋白成为可能。特别是蛋白质数量性状基因座（pQTL）的发现，能够稳健地预测蛋白质丰度。结合pQTL和全基因组关联研究（GWAS）数据，两样本孟德尔随机化（MR）分析为推断基因代理的蛋白质水平与疾病风险之间的因果关系提供了一个强大的框架，能有效减少观察性研究中固有的混杂偏倚。因此，具有因果证据的循环蛋白有望成为有前景的药物靶点。蛋白质组范围孟德尔随机化（PW-MR）分析已在肿瘤学领域取得突破，例如鉴定了结直肠癌（如GDF15）和黑色素瘤（如IL-18）的因果蛋白，并优先考虑了可重用的药物靶点。然而，针对PHC，系统性地探索血浆蛋白质组与疾病的因果关系仍然空白，这限制了我们对其分子病因学和治疗前景的理解。

当前PHC研究的局限性主要体现在两方面：首先，现有的GWAS仅识别出少数易感基因位点（如PNPLA3, TM6SF2），这些位点共同解释了不到5%的PHC遗传力，暗示存在大量未被发现的遗传和蛋白质组学贡献者；其次，尽管体外和动物模型研究提示如AFP和PIVKA-II等蛋白参与PHC进程，但它们究竟是因果介质还是继发性生物标志物仍存争议。此外，循环蛋白与已确立的PHC药物靶点（如VEGF, PD-1/PD-L1）之间的相互作用尚不明确，阻碍了联合治疗策略的开发。

为了填补这些知识空白，一项发表在《Communications Biology》上的研究采用了一种整合因果推断、功能验证和成药性评估的综合方法，旨在优先确定高置信度的PHC治疗靶点。该研究团队进行了一项PW-MR分析，以识别与PHC风险存在因果关联的血浆蛋白。他们利用了包含816例病例和631,599例对照的GWAS荟萃分析数据，并结合了两个大规模血浆蛋白质组数据集（deCODE和UK Biobank Pharma Proteomics Project, UKB-PPP）的信息。研究并未试图对所有潜在靶点进行详尽排名，而是侧重于通过整合共定位分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和多组学功能注释，优先考虑那些具有治疗潜力的靶点，其中特别关注了抑制素βC（INHBC），这主要基于其成药性和后续的机制验证。

在技术方法上，本研究核心整合了多种生物信息学与实验验证手段。首先，对来自IEU OpenGWAS数据库和FinnGen数据库的PHC全基因组关联研究（GWAS）数据进行了荟萃分析。其次，利用deCODE和UKB-PPP两大血浆蛋白质组数据库，获取了数千种血浆蛋白的蛋白质数量性状基因座（pQTL）作为遗传工具变量。随后，采用逆方差加权（IVW）法等孟德尔随机化（MR）方法评估基因预测的蛋白水平与PHC风险的因果关联，并进行贝叶斯共定位、敏感性分析以确保结果稳健。在实验验证部分，研究运用了细胞活力（CCK-8）、增殖（EdU）、迁移（伤口愈合）和侵袭（Transwell）实验，以及qRT-PCR、Western blot、免疫共沉淀、免疫荧光等技术在肝癌细胞系（如HepG2）中探究INHBC-ACVR2B信号轴的功能机制，并最终通过小鼠皮下移植瘤模型评估了ACVR2B抑制剂Bimagrumab的体内抗肿瘤效果。

PW-MR鉴定出27种与PHC存在因果关系的血浆蛋白

通过使用顺式作用pQTL（cis-pQTL）作为遗传工具变量，研究人员分别分析了deCODE队列的1,760种血浆蛋白和UKB-PPP队列的1,947种血浆蛋白。PW-MR分析在经过错误发现率（FDR）校正后，鉴定出27种独特的血浆蛋白与PHC风险存在显著的因果关联。其中，14种蛋白水平的基因预测值与PHC风险呈正相关（即风险因素），而13种呈负相关（即保护因素）。敏感性分析（包括MR-Egger回归、加权中位数法、MR-PRESSO等）未发现明显的水平多效性，且所有蛋白的工具变量强度均稳健。反向MR分析未发现基因预测的PHC对已识别蛋白水平存在因果效应，支持这些蛋白更可能是上游的因果生物标志物，而非疾病的结果。贝叶斯共定位分析进一步支持了NCAN基因座与PHC之间存在共享的因果变异（PPH4 = 0.782）。

PHC相关蛋白的功能注释与成药性优先排序

基于这些因果关联，研究人员利用FUMA平台内的MAGMA进行了基于基因的功能注释。编码这27种蛋白的基因在Hallmark通路中显示出富集，包括补体系统和外源性代谢。组织特异性表达分析显示，22个独特基因在肝脏和大脑中表现出差异表达，其中F7和INHBC主要在肝脏表达。为了优先考虑治疗靶点，PPI网络分析识别出PHC相关蛋白与现有PHC疗法靶点之间存在直接相互作用。通过DrugBank进行的成药性评估强调了18种FDA批准或研究中的药物靶向了5个被优先考虑的蛋白，包括Bimagrumab（ACVR2A/ACVR2B拮抗剂）、Orticumab（OLR1抑制剂）和西妥昔单抗（Cetuximab，靶向EGFR，与C1QA存在关联），这些药物的作用方向与PW-MR效应估计值一致。

INHBC增强肝细胞癌细胞的致癌表型

为了评估INHBC对HCC进展的功能影响，研究人员用不同浓度的重组INHBC蛋白处理HepG2细胞。CCK-8实验显示INHBC以剂量依赖的方式增加细胞活力。EdU掺入实验表明，INHBC（8和16 ng/μL）显著增强了细胞增殖。伤口愈合实验和Transwell侵袭实验进一步证实，INHBC处理能显著促进HepG2细胞的迁移和侵袭能力。这些数据共同确立了INHBC是HCC细胞增殖、迁移和侵袭的有效驱动因子。

INHBC受体ACVR2A/B在HCC中的过表达及其与INHBC的功能相互作用

比较分析显示，与正常肝细胞（LO2）相比，HCC细胞（HepG2）中INHBC的受体ACVR2A和ACVR2B在mRNA和蛋白水平均显著上调。免疫共沉淀实验验证了INHBC与ACVR2B之间存在直接结合。免疫荧光将ACVR2B定位于HepG2细胞的质膜。当使用选择性ACVR2B抑制剂Bimagrumab与INHBC共同处理HepG2细胞时，Bimagrumab显著减弱了INHBC诱导的增殖效应。这些结果突出了ACVR2A/B受体在肝癌细胞中的高表达，并证明INHBC通过激活ACVR2B促进细胞增殖，靶向该受体具有治疗潜力。

INHBC通过激活ACVR2B-SMAD2通路驱动细胞周期进程

机制研究表明，INHBC处理能显著增加HepG2细胞中磷酸化Smad2（p-Smad2）的水平，并诱导ACVR2B发生核转位。同时，INHBC显著上调了细胞周期调控蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D1和Cyclin E的表达。而Bimagrumab的共处理可消除这些效应，将p-SMAD2和细胞周期蛋白水平降低至基线。通过siRNA敲低ACVR2B，可以显著削弱INHBC诱导的Smad2磷酸化；而在敲低细胞中重新导入ACVR2B则能恢复INHBC对p-Smad2的诱导作用。免疫荧光分析显示INHBC处理促进了Smad2的核转位。这些结果确证INHBC通过ACVR2B激活Smad2信号通路，进而调控细胞周期进程。

INHBC通过ACVR2B依赖性机制在体内加速肿瘤生长

在体内实验中，建立了HepG2细胞的小鼠皮下移植瘤模型。与对照组相比，INHBC处理显著促进了肿瘤生长，增加了肿瘤体积和重量。然而，联合使用Bimagrumab可显著抑制INHBC驱动的肿瘤生长，使肿瘤体积减少约42%（与INHBC单独处理组相比，P=0.008）。这表明靶向抑制ACVR2B能有效阻断INHBC的促瘤作用。

综上所述，这项研究通过整合PW-MR、功能基因组学和临床前验证，将INHBC确立为PHC发病机制的一个新型因果介质，并提出ACVR2B抑制是一种有前景的治疗策略。研究的主要发现包括：首先，PW-MR分析揭示了27种与PHC风险存在因果关系的血浆蛋白，扩展了对该恶性肿瘤遗传架构的认识；其次，对首要候选蛋白INHBC的功能表征证明了其通过激活ACVR2B-Smad2信号轴发挥致癌作用；第三，使用Bimagrumab进行ACVR2B的药理学阻断在体外和体内实验中均显著减弱了INHBC驱动的肿瘤发生。这项研究的方法学创新体现在垂直整合cis-pQTL与共定位分析确保因果推断的时间明确性、全面的敏感性分析增强结果可靠性，以及遗传预测与实验验证的融合创建了一个自我强化的发现流程。尽管存在PHC队列规模可能限制对罕见变异的检测、MR假设的线性关系可能忽略非线性动力学、临床前模型的局限性以及Bimagrumab最初并非为靶向ACVR2B设计等限制，但本研究为将蛋白质组学因果推断转化为具有机制依据的治疗假设提供了范例，有望推动PHC精准肿瘤学的发展。未来的研究方向包括在免疫正常的PHC模型和ICC类器官中验证发现，开展基于INHBC生物标志物和ACVR2B分层的Bimagrumab治疗临床试验，以及利用单细胞多组学方法进一步阐明INHBC在免疫逃避和代谢重编程中的作用。