靶向结核分枝杆菌细胞壁核心组装蛋白CpsA的化合物ACA的发现及其抗结核作用机制研究

《Communications Biology》：ACA kills Mycobacterium tuberculosis and M. bovis by targeting cell wall core assembling protein CpsA

本研究针对结核病(TB)耐药性问题，发现化合物3-azidothiophene-2-carboxylic acid(ACA)可通过靶向LytR-CpsA-Psr(LCP)家族蛋白CpsA1和CpsA2，抑制其焦磷酸酶活性，破坏阿拉伯半乳聚糖(AG)与肽聚糖(PG)的连接，从而干扰结核分枝杆菌(Mtb)细胞壁核心组装过程。该研究为应对多药耐药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)提供了新的候选药物靶点。

　　

结核病(TB)至今仍是全球重大公共卫生威胁，每年导致数百万人感染和百万人死亡。更严峻的是，多药耐药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的出现使得现有治疗方案效果大打折扣。尽管在过去十年中仅有bedaquiline(BDQ)、delamanid(DLM)和pretomanid(PMD)三种具有创新作用机制的抗结核药物获批，但针对结核分枝杆菌(Mtb)特有细胞壁组装过程的直接靶向药物仍属空白。

结核分枝杆菌的成功生存很大程度上依赖于其独特的细胞壁结构。这种复杂的多层结构由细胞质膜、细胞壁、表面脂质和荚膜组成，其中以脂质和碳水化合物为主的不寻常成分为细菌提供了渗透屏障，保护其免受亲水性药物的攻击。细胞壁核心结构包含三个关键元素：肽聚糖(PG)聚合物、高度分支的阿拉伯半乳聚糖(AG)和长链分枝菌酸。正是这种特殊的结构使得细胞壁生物合成途径成为抗结核药物开发中少数经过充分验证的靶点之一。

在这一背景下，LytR-CpsA-Psr(LCP)家族蛋白作为潜在的抗生素靶点引起了研究人员的关注。这些蛋白参与细胞壁核心组装过程，负责将阿拉伯半乳聚糖(AG)共价连接到肽聚糖(PG)上。结核分枝杆菌基因组编码三种LCP候选蛋白：CpsA1、CpsA2和Rv0822c。已有研究表明，CpsA1和CpsA2在AG与PG的共价连接中起关键作用，其中CpsA1在这一过程中占主导地位。CpsA1的缺失会显著抑制Mtb的生长速率并使其对几种抗生素敏感，而CpsA1和CpsA2的联合失活则是致死性的。此外，CpsA2还被证明可以抑制宿主NADPH氧化酶和LAP蛋白，拮抗先天免疫反应。

先前的研究表明，化合物3-azidothiophene-2-carboxylic acid(ACA)能有效抑制结核分枝杆菌H37Rv和临床分离的多药耐药(MDR)结核分枝杆菌菌株的生长，但其精确的抗菌机制尚不清楚。为了阐明ACA的作用机制及其潜在应用价值，研究人员开展了一系列深入实验。

主要关键技术方法包括：通过全基因组测序鉴定ACA耐药突变位点；利用同源重组技术构建基因敲除菌株；采用蛋白纯化与酶活性分析测定ACA对CpsA1和CpsA2焦磷酸酶活性的影响；应用药物亲和反应靶点稳定性(DARTS)实验验证ACA与靶蛋白的直接结合；使用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察ACA处理后的细菌形态学变化；通过时间-杀灭实验评估ACA的杀菌动力学。

ACA抑制Mtb和牛分枝杆菌的生长

研究人员首先评估了ACA对各种分枝杆菌和非分枝杆菌菌株生长的抑制效果。结果显示，ACA能有效抑制牛分枝杆菌BCG(MIC：17.7μM)和结核分枝杆菌H37Ra(MIC：35.4μM)的生长，而对耻垢分枝杆菌的活性较低(MIC：141.9μM)，对海分枝杆菌和非分枝杆菌物种(包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和苏云金芽孢杆菌)则未观察到抗菌活性。这些结果表明ACA对缓慢生长的分枝杆菌物种(如结核分枝杆菌和牛分枝杆菌)具有特异性活性。

杀灭动力学实验表明，ACA表现出剂量依赖性的杀菌活性，在5倍MIC浓度下处理4天，可使菌落形成单位(CFUs)减少约10,000倍。此外，ACA对骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)无明显细胞毒性，并能减少BCG和H37Ra菌株在BMDMs内的存活。

cpsA2突变导致分枝杆菌对ACA耐药

为探究ACA的抗菌机制，研究人员筛选并分离了ACA耐药突变菌株。全基因组测序发现，两个ACA耐药突变株(AR01和AR02)均在cpsA2连接酶基因中存在单核苷酸变异，导致CpsA2蛋白V221E突变。实验证明，在AR01菌株中过表达野生型cpsA2基因可部分恢复对ACA的敏感性，而cpsA2缺失的H37Ra菌株在ACA存在下生长优于野生型菌株，且这一表型可通过cpsA2回补而逆转。

CpsA1可逆转cpsA2突变菌株的ACA耐药表型

研究人员进一步探讨了结核分枝杆菌中三种LCP样蛋白的功能关系。实验表明，在AR01突变体中过表达cpsA1可明显恢复对ACA的敏感性，而Rv0822c则几乎不影响AR01突变体的耐药表型。cpsA1缺失的H37Ra菌株在无ACA时表现出明显的生长缺陷，但在ACA处理条件下，cpsA1缺失反而促进了分枝杆菌生长，且cpsA1回补可部分逆转这一表型。

ACA抑制CpsA1和CpsA2的焦磷酸酶活性

研究人员通过体外酶活实验发现，去除跨膜结构域的CpsA1和CpsA2突变体均表现出时间依赖性和蛋白浓度依赖性的焦磷酸酶活性。ACA能以剂量依赖方式抑制CpsA1和CpsA2的焦磷酸酶活性，IC₅₀值分别为419.3μM和410μM。DARTS实验进一步证实ACA可直接与CpsA1和CpsA2结合，而阴性对照药物乙胺丁醇(EMB)则无此作用。

ACA干扰分枝杆菌细胞壁合成

细胞壁通透性实验显示，cpsA1或cpsA2缺失的H37Ra菌株及ACA处理的分枝杆菌均表现出细胞壁通透性增加和对多种抗生素的敏感性增强。扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察发现，ACA处理菌株和cpsA1/cpsA2缺失菌株的细胞表面出现明显皱褶，细胞外层受损，且ACA处理的H37Ra和BCG菌株的细胞长度显著增加。

联合用药实验表明，ACA(29.6μM)与万古霉素(VAN，0.276μM)联合使用时的杀菌效果显著优于单药治疗， fractional抑制浓度指数(FICI)≤1，表明两种药物之间存在叠加效应。而ACA与异烟肼(INH)联合未观察到显著增强效果。

研究结论与讨论部分指出，本研究成功鉴定了一个小分子化合物ACA，其对缓慢生长的结核分枝杆菌具有良好的杀菌活性。ACA通过靶向LCP蛋白CpsA1和CpsA2，抑制其焦磷酸酶活性，从而干扰分枝杆菌细胞壁组装过程。这一发现不仅确定了一种潜在的分枝杆菌杀菌化合物，还阐明了其具体的抗菌机制。

值得注意的是，ACA对分枝杆菌表现出特异性活性，对非分枝杆菌物种(如金黄色葡萄球菌)无明显活性，尽管这些细菌中也存在LCP蛋白。这种特异性可能源于不同细菌间分枝菌酸结构的差异、靶标LCP蛋白的氨基酸序列、构象结构或表达水平的不同。序列比对显示，结核分枝杆菌CpsA1与耻垢分枝杆菌CpsA1的序列同一性为70%，而结核分枝杆菌CpsA2与耻垢分枝杆菌CpsA2的序列同一性仅为39%。此外，CpsA2与金黄色葡萄球菌LCP家族蛋白的序列同一性为15%，CpsA1与金黄色葡萄球菌LCP家族蛋白的序列同一性为16%。

本研究的一个重要发现是CpsA1和CpsA2在调节分枝杆菌对ACA敏感性方面具有功能相似性。这两种蛋白均参与细胞壁核心组装过程，促进阿拉伯半乳聚糖(AG)与肽聚糖(PG)的连接。实验证明，CpsA2表达可以挽救cpsA1缺失菌株的生长缺陷，而CpsA1可以逆转cpsA2突变菌株的ACA耐药表型。

另一个重要发现是ACA通过破坏细胞壁核心组装来杀灭分枝杆菌。与现有抗结核药物(如异烟肼抑制分枝菌酸合成、乙胺丁醇干扰阿拉伯半乳聚糖合成)不同，ACA靶向的是AG和PG连接所必需的CpsA1和CpsA2蛋白，代表了一种先前未表征的抗分枝杆菌策略。

ACA与万古霉素的明显叠加效应可能机制是ACA损害细胞壁完整性，从而增强万古霉素渗透到其靶标(肽聚糖前体的D-Ala-D-Ala末端)的能力。而ACA与异烟肼联合未显示协同效应可能反映了代谢干扰——ACA诱导的细胞壁应激可能降低异烟肼的KatG依赖性激活。

尽管ACA显示出良好的抗结核活性，但其治疗潜力仍存在明显局限性。ACA表现出中等程度的细胞内功效，可能是由于其跨宿主细胞的渗透性有限。其水溶性仍然是一个挑战，这阻碍了进行高分辨率结构研究以明确验证靶标结合。此外，与一线结核病药物(如异烟肼)未观察到协同效应，强调了其相互作用的特异性。因此，虽然ACA代表了抗结核药物开发中有前景的化学支架，但其本身尚不是候选药物。未来的努力应通过系统化学优化来解决这些局限性。

总之，本研究表征了一种分枝杆菌杀菌化合物ACA，它靶向LCP蛋白(CpsA1和CpsA2)并抑制其磷酸转移酶活性。这最终导致分枝杆菌死亡，因为细菌细胞壁的组装被破坏，无法形成正确的生理结构。该工作为开发新型抗结核药物提供了替代策略。