大肠杆菌F质粒TraT表面排斥蛋白的冷冻电镜结构解析及其物理干扰机制研究

《Communications Biology》：Structure of the conjugation surface exclusion protein TraT

本研究针对细菌接合过程中质粒表面排斥机制不清的问题，通过冷冻电镜解析了IncF质粒TraT排斥蛋白的同源十聚体结构，发现其采用跨膜α螺旋的独特膜定位方式。研究人员开发荧光显微镜接合实验证实TraT不依赖特异性相互作用，而是通过物理干扰机制抑制接合作用，为理解抗生素耐药基因传播提供了新视角。

　　

在微生物世界中，细菌通过一种被称为接合（conjugation）的"社交行为"交换遗传物质，这种直接细胞间DNA转移是抗生素耐药性传播的主要途径。其中，F质粒作为研究接合机制的模型系统，其编码的TraT蛋白早在40年前就被发现能够介导表面排斥（surface exclusion）——防止已携带质粒的受体菌重复接收相同质粒。然而，这个定位在外膜（outer membrane）的脂蛋白如何精确识别并阻断接合过程，始终是未解之谜。更令人困惑的是，TraT还被发现具有抵抗血清补体、抗吞噬等多重功能，其同源物甚至广泛存在于病原菌染色体中，暗示其可能采用一种不依赖特异性识别的通用机制。

近日，《Communications Biology》发表了牛津大学Ben C. Berks团队的研究成果，他们通过高分辨率冷冻电镜（cryo-EM）首次解析了F质粒TraT蛋白的精细结构，并结合创新的显微镜接合实验，揭示了其通过物理干扰而非特异性相互作用实现表面排斥的新机制。

研究采用冷冻电镜单颗粒分析技术解析TraT结构，通过荧光显微镜接合实验评估功能，利用免疫印迹验证蛋白表达，并采用生物信息学分析序列保守性。

Structure of the F plasmid TraT complex

研究人员发现TraT形成一个罕见的同源十聚体，整体呈"厨师帽"形状，内部具有贯穿长轴的腔体结构。每个亚基包含球状核心结构域、两个跨膜α螺旋（transmembrane α-helices, TMHs）以及长的β-发夹结构。值得注意的是，与大多数外膜蛋白采用β-桶状结构不同，TraT利用TMHs锚定在外膜上，这在外膜蛋白中极为罕见。结构比对显示其核心结构与脂多糖运输蛋白LptE相似，但关键残基不保守，排除了LPS结合功能。

The previously proposed specificity region of TraT does not influence the exclusion phenotype

为验证早期研究提出的"排斥特异性序列"（137NSAGA141），团队开发了基于荧光阻遏蛋白操作系统（FROS）的显微镜接合实验。该方法通过TetR-mNeonGreen标记接合质粒，实现转接合子（transconjugant）的自动检测。实验显示，不同TraT变体（NSAGA、NSAGG、SSAGA）在严格控制表达水平的情况下，排斥指数（exclusion index, EI）无显著差异，否定了该序列决定质粒特异性的假说。

Disruption of conserved residues on the internal surface of TraT does not abolish surface exclusion

通过Consurf保守性分析发现TraT腔内高度保守的R213-D170盐桥对，但定点突变实验表明这些残基的电荷中和（D170A、R213A）或反转（R213E）均未完全消除排斥功能，说明TraT不依赖保守界面与接合装置特异性相互作用。

讨论与结论

本研究颠覆了传统认知：TraT并非通过特异性识别接合菌毛（pilus）或屏蔽受体蛋白（如OmpA）实现排斥，而是通过其刚性十聚体结构改变外膜物理特性，机械性阻碍菌毛穿透。这种"物理屏障"模型可同时解释其多重生物学功能——高丰度的TraT复合体通过增加外膜机械强度，既抑制菌毛插入又抵抗补体攻膜复合物（MAC）形成。研究还指出TraT的TMH结构可能反映其独特的生物发生途径，规避了常规BAM装置对β-桶状蛋白的插入限制。

该工作不仅首次揭示TraT的精细结构和作用机制，还为开发干扰质粒传播的新策略提供了靶点。由于TraT在病原菌中广泛存在，针对其物理屏障特性的干预可能成为控制抗生素耐药性传播的新思路。