开发并验证了一种基于LC-Orbitrap-HRMS的技术，用于定量人胰岛素及部分胰岛素类似物，并将其应用于两起法医案例中

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Development and validation of an LC-Orbitrap-HRMS method for quantification of human insulin and selected insulin analogues with application on two forensic cases

本研究建立并验证了LC-Orbitrap-HRMS方法用于检测血浆、肝、肾和脂肪组织中完整胰岛素及其类似物，在脂肪组织中实现1ng/mL的检测限，准确度达94.1%-100.2%，并成功应用于两例 fatal胰岛素过量死亡案件，证实该方法在法医鉴定中的可靠性。

　　

余忠豪|袁宇豪|张嘉鑫|陶静|高航|高向婷|周义武

华中科技大学同济医学院法医学系，武汉，430030，中国

摘要

胰岛素是一种对血糖调节至关重要的肽类激素，在临床实践中通常通过免疫测定法进行定量分析。尽管这些方法灵敏度高，但缺乏特异性，因此在法医学鉴定和定量分析中往往不够准确。为了解决这一问题，我们开发并验证了一种液相色谱-轨道阱高分辨质谱（LC-Orbitrap-HRMS）方法，用于测定四种尸检样本（血浆、肝脏、肾脏和脂肪组织）中完整胰岛素及其类似物的含量。方法验证表明，该方法在血浆中对人胰岛素的定量范围为0.1至100 ng/mL，准确度在90.1%至106.9%之间。值得注意的是，在脂肪组织等复杂样本中，该方法的最低检测限（LLOQ）为1 ng/mL，准确度范围为94.1%至100.2%，显示出良好的分析性能。该方法被应用于两起疑似胰岛素过量的法医案例中，结果显示注射部位皮下脂肪组织中的胰岛素浓度显著升高，分别为743.1 ng/mL和53.2 ng/mL。这些结果证明了该方法在调查疑似致命性胰岛素中毒事件中的实用性。

引言

人胰岛素是胰腺β细胞分泌的唯一内源性降糖激素，由一条21个氨基酸组成的A链和一条30个氨基酸组成的B链通过三个二硫键（A7-B7、A20-B19和A6-A11）连接而成[1]。合成胰岛素类似物（包括速效类似物如赖脯胰岛素、阿斯帕肽胰岛素和甘精胰岛素，以及长效类似物如德泰米尔胰岛素、甘精胰岛素和德谷胰岛素）是通过改变内源性胰岛素的结构而开发的[2]。这些胰岛素类似物在治疗上非常重要，主要用于1型糖尿病的治疗，也可用于晚期2型糖尿病[3]。然而，由于其强大的降糖作用，它们在故意滥用或意外过量使用时也会增加严重低血糖甚至致命后果的风险[4]。全球范围内因胰岛素过量导致的死亡报告不断增加，这凸显了需要开发灵敏且特异的分析方法来测定生物样本中的胰岛素类似物[5]。

在临床实践中，胰岛素通常通过免疫测定法进行检测，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射免疫测定（RIA）或化学发光免疫测定（CLIA），这些方法能够有效检测体内的胰岛素总量[6]。然而，这些方法在法医学应用中存在交叉反应的问题，并且无法区分结构相似的胰岛素类似物，从而影响了需要精确鉴定和定量的场合的特异性[7]。因此，液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）因其优异的选择性、灵敏度和多组分分析能力，已成为检测复杂生物样本中胰岛素类似物的首选方法[8]。然而，现有的LC-HRMS方法主要集中在血浆样本上，关于其在组织（如肝脏、肾脏或脂肪组织）中的分布的数据非常有限[9]。此外，样本制备、色谱条件和质谱参数的不一致性也阻碍了方法的标准化。

为了填补这些空白，我们开发并验证了一种LC-Orbitrap-HRMS方法，用于测定四种尸检样本（血浆、肝脏、肾脏和脂肪组织）中完整的人胰岛素及其合成类似物的含量。该方法成功应用于两起致命性胰岛素中毒案例，证明了其在胰岛素过量法医调查中的技术支持和科学价值。

方法验证

方法验证遵循欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）的指南[12][13]，评估了方法的特异性、携带效应、基质效应、提取回收率、线性、准确度和精密度。数据使用Xcalibur和Origin 2024软件进行处理，统计分析则通过GraphPad Prism 8软件完成。

法医应用

验证后的方法被应用于两起疑似致命性胰岛素过量的独立法医案例中。通过CLIA和LC-Orbitrap-HRMS方法测定了注射部位皮下脂肪组织、肝脏和血浆中的胰岛素浓度。所有样本在分析前均保存在-80°C。本研究得到了死者家属的知情同意，并得到了华中科技大学医学伦理委员会的批准。

方法开发

为了建立一种灵敏的胰岛素及其类似物检测平台，我们比较了三种LC-MS系统（三重四极杆质谱、飞行时间质谱和轨道阱质谱）在检测胰岛素标准品时的性能。如补充材料Section S1所述，轨道阱质谱系统表现出更高的灵敏度，100 ng/mL的猪胰岛素标准品的信号强度为1.27×10^7，与其他平台相比，该浓度下的信号强度是其100倍。这与文献报道的优势一致。

结论

本研究重点开发并验证了一种LC-Orbitrap-HRMS方法，用于测定血浆、肝脏、肾脏和脂肪组织中人胰岛素及其选定合成类似物的含量。通过优化PPT和MAX-SPE联合样本制备方法，该方法能够同时测定这些不同组织中的胰岛素含量。方法验证结果显示，该方法具有合适的线性、准确度、精密度和灵敏度，适用于法医学分析。

资助

无

作者贡献声明

高向婷：撰写、审稿与编辑、监督、概念设计。 高航：撰写、审稿与编辑、方法验证。 陶静：撰写、审稿与编辑、资源协调。 张嘉鑫：撰写、审稿与编辑、监督、方法设计。 袁宇豪：撰写、审稿与编辑、方法验证、资源协调、实验设计。 周义武：撰写、审稿与编辑、监督。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。