基于正交多线扫描的高速定量图像扫描显微镜

《Optics & Laser Technology》：High-Speed quantitative image scanning microscopy based on orthogonal Multi-Line scanning

高速定量成像显微镜（fqISM）基于正交多线扫描技术，通过圆柱透镜阵列生成多平行照明束，同步采集多通道信号并融合数字强度校正，在保持亚衍射极限分辨率的前提下将成像速度提升至传统线扫描系统的三倍以上。实验与仿真均验证其有效消除线扫描方向性分辨率差异，实现大视野高信噪比动态成像。

　　

作者列表：楚文雪、李一通、文在行、罗汉、龙永涛、郭维宁、刘学明、马东林

华中科技大学光电子信息技术学院及武汉国家光电子实验室，中国武汉430074

摘要

共聚焦显微镜因其卓越的光学切片能力而成为重要的成像工具，但它面临着一些挑战，包括严格的共轭焦点对准要求、较慢的扫描速度以及光子利用效率低的问题。图像扫描显微镜（ISM）通过用高灵敏度阵列探测器替代单点探测器，显著提高了光子效率。然而，其传统的点扫描方法从根本上限制了成像速度。为了克服这些限制，我们提出了一种基于正交多线扫描的快速定量图像扫描显微镜（fqISM）技术。该方法使用圆柱形透镜阵列生成多条平行线光源，同步采集多通道信号，并通过结合数字强度校正的正交双扫描策略实现高保真度图像重建。通过系统仿真和实验验证（辅以定量统计分析）的综合评估，证实fqISM在保持亚衍射极限分辨率的同时加快了成像速度，数字强度校正进一步确保了整个视场内图像的定量均匀性。

引言

共聚焦显微镜作为生物医学成像和材料表征领域的重要工具，由于其出色的光学切片能力和信噪比优势，在细胞动态观察和三维结构分析中发挥着关键作用[[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]]。其核心技术在于使用点扫描模式结合共轭针孔物理滤波来选择性地抑制焦外背景光，从而获得高对比度的光学切片图像。然而，共聚焦显微镜存在共轭焦点对准、扫描速度慢和光子利用效率低等问题。在这种背景下，作为新一代超分辨率显微镜技术的图像扫描显微镜（ISM）发展迅速[[7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]]。该技术使用高灵敏度阵列探测器代替传统的单点探测器，不仅保留了共聚焦光学切片能力，还获取了扫描点的空间光强度分布信息，提高了系统的光子利用效率，并结合像素重分配算法进行了空间域重建[[14], [15], [16]]。在此基础上，研究人员通过多焦点并行扫描和线扫描等创新扫描模式提高了成像速度，以满足对微观目标的运动跟踪需求[[17], [18], [19], [20], [21], [22]]。

在大场成像领域，线扫描方案相比点扫描具有更大的成像速度优势。然而，这种单向快速扫描策略在空间频率域覆盖上引入了不对称性：由于连续采样，沿扫描方向的频率域信息得以完全保留，而垂直于扫描方向的频率域则受到探测器像素积分效应的限制，导致横向分辨率的各向异性。研究人员提出了一种正交扫描策略，通过收集两组相互垂直的原始数据来实现频率域的各向同性分辨率提升[17,23]。具体措施包括：首先使用十字形线光源进行同步激发，这可以在一次扫描中完成，但会增加系统复杂性；其次使用单束光进行二维正交扫描，由于两次扫描过程，成像时间会加倍。

本研究提出了一种基于正交多线扫描的快速定量图像扫描显微镜技术（fqISM）。该方法使用圆柱形透镜阵列生成多条平行光束，通过同步多通道信号采集实现高速图像合成。创新地，它采用正交双扫描策略消除了线扫描方法固有的方向依赖性。系统无需预校准即可通过通道融合因子实现自适应强度补偿，显著增强了横向分辨率的各向同性。此外，我们建立了一个涵盖光源-样品-探测器链的端到端仿真模型，以定量评估成像性能。实验验证表明，与传统线扫描图像扫描显微镜相比，fqISM在保持亚衍射极限分辨率的同时大幅提高了成像速度。通过数字强度校正，它进一步实现了整个视场内图像信息的定量均匀性。

技术细节

快速定量图像扫描显微镜系统

fqISM的光学配置如图1所示。488纳米半导体激光器（CNI, MDL-III-488-SM）提供光源。镜子M1和M2将光束准直后，通过扩束器（JCOPTIX, OSAE10-T2）进行扩展。扩展后的光束随后照射安装在旋转位移台（Lbtek, EM-RP60）上的圆柱形透镜阵列（Lbtek, PBCLA25-488–8-SP, f = 8 mm）。该阵列的受控旋转生成可正交扫描的线性光束图案，从而实现...

仿真结果

为了验证fqISM的性能，我们基于光学场Kirchhoff衍射模型（结合角谱方法和Fraunhofer衍射近似）对整个系统进行了全面的端到端仿真[27,28]。该仿真模拟了从光源到与样品相互作用再到最终检测的整个光学路径，包括激光束扩展、圆柱形透镜阵列的聚焦等过程。

讨论

与共聚焦系统相比，ISM在光子利用效率上有显著提升，但其成像速度仍低于宽场显微镜。相对于点扫描方法，线扫描ISM显著提高了成像速度；然而，单向扫描引入了分辨率各向异性。通过实施正交双向扫描并结合后续图像融合，可以有效解决这一问题，从而实现各向同性成像。

结论

本研究提出了一种基于多线并行扫描和正交扫描融合的图像扫描显微镜方案，显著提升了ISM的成像速度和定量性能。为了验证该方案的优越性，我们通过仿真和实验进行了系统评估：在仿真测试中，使用空间域和频率域样本进行重建比较，并评估了定量性能；在...

作者贡献声明

楚文雪：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、方法论设计、数据整理。 李一通：可视化处理。 文在行：方法论设计。 罗汉：软件开发。 龙永涛：可视化处理。 郭维宁：形式化分析。 冉安：软件开发。 马东林：资源管理、项目协调、方法论设计、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。