这种昆虫病原真菌——球孢白僵菌（Beauveria bassiana）会分泌一种新的效应蛋白，这种蛋白对于真菌在宿主体内的定殖至关重要

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：The insect pathogenic fungus Beauveria bassiana excretes a novel effector essential for fungal colonization within the hosts

效应蛋白BbTsp1通过直接相互作用抑制宿主抗菌肽，重组菌株毒力增强。

　　

康伟|丁金莉|王雪婷|高本杰|冯明光|应胜华

中国浙江省杭州市浙江大学生命科学学院植被结构、功能与构建国家重点实验室（VegLab），邮编310058

摘要

病原真菌通过效应子介导的策略来应对宿主的免疫系统。然而，在昆虫病原真菌中，关于效应子的信息仍然知之甚少。海藻糖是昆虫病原真菌在宿主体内定殖的主要碳源。本研究采用比较蛋白质组学分析方法，研究了以海藻糖为碳源培养的Beauveria bassiana的细胞外蛋白质组。结果显示，在海藻糖培养基中特异性检测到了10种蛋白质，其中一种富含半胱氨酸的小分泌蛋白（命名为BbTsp1）被认为是一种潜在的效应子。基因功能分析表明，BbTsp1参与了细胞壁破坏、无性繁殖以及B. bassiana的毒力增强。值得注意的是，BbTsp1对昆虫宿主具有毒性。通过Pull-down实验结合质谱分析，确定了BbTsp1在宿主血淋巴中的潜在相互作用蛋白。进一步研究表明，BbTsp1与抗菌肽gloverin之间存在直接相互作用。通过过表达BbTsp1构建的重组菌株表现出更强的毒力。这些发现表明，BbTsp1作为一种新型效应子，通过直接与抗菌肽相互作用来保护真菌病原体。本研究加深了对真菌-宿主相互作用的理解，并提出了一种提高昆虫病原真菌生物防治效果的新策略。

引言

像Metarhizium和Beauveria这样的昆虫病原真菌（EPF）由于其对抗昆虫害虫的能力和环保特性而被广泛用作生物防治剂（Quesada-Moraga等人，2024年）。真菌的分生孢子通过附着在宿主表皮表面并发育成侵入性菌丝来启动感染过程（Ortiz-Urquiza和Keyhani，2013年；Swathy等人，2024年；Vivekanandhan等人，2024年）。在宿主体内，真菌入侵者会触发系统的免疫反应，包括体液免疫和细胞免疫。体液免疫的特征是产生活性氧和抗菌肽，而细胞免疫则涉及吞噬作用、包裹和结节形成（Vertyporokh等人，2020年）。为了逃避宿主的免疫防御，EPF进化出了多种策略，例如分泌免疫抑制性次级代谢产物以及利用碳水化合物和蛋白质重塑细胞壁（Ding等人，2020年）。越来越多的研究表明，在真菌-昆虫相互作用中，效应子介导了真菌对宿主免疫防御的逃避。B. bassiana分泌一种赖氨酸基序蛋白（LysM）作为效应子，该蛋白可以与真菌细胞壁中的几丁质纤维结合，从而保护真菌细胞免受免疫识别和酶解（Cen等人，2017年）。在Drosophila melanogaster中，Gram-negative结合蛋白3（GNBP3）和GNBP样蛋白3作为β-葡聚糖受体，触发宿主的抗真菌反应。M. robertsii分泌效应子Tge1，靶向GNBP3和GNBP样蛋白3以抑制宿主免疫（Lu等人，2024年）。此外，昆虫半胱氨酸蛋白酶Persephone能够识别来自真菌病原体的蛋白酶并激活宿主的免疫反应。然而，M. robertsii还利用效应子Fkp1来靶向宿主的半胱氨酸蛋白酶，从而阻断病原体的感知机制（Tang等人，2025年）。显然，昆虫病原真菌进化出了多种效应子介导的策略来应对宿主的免疫系统，但是否存在其他策略仍有待探讨。

在昆虫的血淋巴中含有丰富的营养物质，其中海藻糖是主要的能量来源（Thompson，1999年；Lu等人，2014年）。昆虫病原真菌通过两种机制利用宿主的海藻糖作为碳源：一种是通过酶依赖途径，EPF分泌海藻糖水解酶来降解海藻糖并吸收产生的葡萄糖（例如M. anisopliae中的酸性海藻糖酶，Xia等人，2002年）；另一种是通过主动转运蛋白直接吸收海藻糖（例如B. bassiana中的α-葡萄糖苷转运蛋白，Wang等人，2013年）。在真菌中，不同的碳源会影响其生长和细胞外蛋白质的合成（Dalmau等人，2000年；Dominguez等人，2003年）。因此，推测海藻糖可能诱导EPF产生特定的分泌蛋白组。

在本研究中，以B. bassiana作为EPF的代表，探讨了宿主-真菌相互作用中的分泌蛋白。首先评估了海藻糖对真菌分泌蛋白组的影响，并从特异性诱导的蛋白质中筛选出潜在的效应子，随后对其进行了功能分析，并利用该效应子构建了毒力增强的转基因菌株。

研究片段

微生物与培养基

B. bassiana ARSEF2860菌株来自美国农业部昆虫病原真菌收藏库（纽约州伊萨卡），在本研究中作为野生型菌株使用。包括转基因菌株在内的所有真菌菌株均在含有4%葡萄糖、1%蛋白胨和1.5%琼脂以及1%酵母提取物的SDAY培养基中于25°C条件下培养。培养7天后收集分生孢子，用于基因改造和表型分析。Escherichia coli DH5α（Invitrogen）也在相同培养基中培养。

两种培养基中B. bassiana分泌蛋白的比较分析

如表S2所示，在GPB和TPB培养基中培养的B. bassiana的分泌蛋白组中检测到162种蛋白质，其中10种蛋白质仅在TPB培养基中特异性出现。在TPB分泌蛋白组中，一种被标记为“分泌蛋白”的蛋白质（基因位点：BBA_09766；GenBank编号：EJP61291）被命名为trehalose secretome protein 1（BbTsp1）。BbTsp1由156个氨基酸组成，其中包含10个半胱氨酸残基。该蛋白质除了一个特定的结构域外，不包含其他可预测的结构域。

讨论

一类富含半胱氨酸但缺乏特定结构域的小分子蛋白在病原真菌中普遍存在，并在病原体-宿主相互作用中发挥重要作用（Jiang等人，2020年；Zhu等人，2023年）。本研究鉴定了B. bassiana分泌蛋白中的一个效应子，并确定了其作用靶标及潜在应用。

在昆虫的血淋巴中，海藻糖是主要的能量来源（Thompson，1999年；Lu等人，2014年）。

CRediT作者贡献声明

康伟：撰写初稿、数据可视化、验证、方法学设计、实验实施、数据分析、数据整理。丁金莉：方法学设计、实验实施。王雪婷：数据分析。高本杰：资金获取、数据分析。冯明光：撰写、审稿与编辑、资源协调。应胜华：撰写、审稿与编辑、实验监督、资源管理、资金获取、研究概念构思。

资助

本研究得到了中国国家重点研发计划（2024YFD2300502，资助对象S.Y.）和中国浙江省自然科学基金（LQN25C140002，资助对象B.G.；LZ24C140002，资助对象S.H.）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。