利用能够穿透细胞壁的肽TAT提高Phytophthora infestans中RNAi（RNA干扰）的效率

《Physics of Life Reviews》：Enhancing RNAi efficiency in Phytophthora infestans using cell-penetrating peptide TAT

使用TAT肽增强拟南芥晚疫病菌对dsRNA的摄取，证实其高效内化及RNAi诱导效果，并发现TAT肽可通过植物维管系统长距离运输。

　　
### 研究背景与意义
植物病原体如晚疫病菌（Phytophthora infestans）的防控长期面临挑战。传统化学农药存在抗药性、环境污染等问题，而基于RNA干扰（RNAi）的基因沉默技术因具有高靶向性和环境友好性备受关注。然而，RNAi技术的核心障碍在于外源dsRNA的细胞摄取效率低下，尤其是对天然dsRNA摄取能力有限的病原体。细胞穿透肽（CPPs）作为新型分子载体，已在生物医学领域展现潜力，但其在植物病原体中的应用尚不明确。本研究聚焦于TAT肽（来源于HIV转录激活蛋白）在提高晚疫病菌对dsRNA的摄取效率及RNAi效率中的作用，旨在为开发新型农业生物防治技术提供理论支持。

### 研究方法
1. **材料与实验设计**
- **病原体培养**：使用晚疫病菌标准菌株CBS 120920，在含Rye B琼脂的平板上培养至5-7天，收集孢子囊悬浮液用于实验。
- **CPP筛选**：对比四种常用CPPs（TAT、Arg9、MAP、Tp10）的穿透效率，通过荧光标记观察孢子囊和菌丝的摄取情况。
- **机制分析**：
- **动力学研究**：通过实时荧光显微成像，监测TAT肽在孢子囊和菌丝中的积累动态（时间范围0-60分钟）。
- **代谢依赖性验证**：使用2-脱氧-D-葡萄糖（抑制糖酵解）、亚硝酸钠（抑制ATP水解）和氯丙嗪（抑制吞噬体形成）验证TAT肽摄取是否依赖能量或特定内吞途径。
- **细胞壁完整性分析**：通过扫描电镜（SEM）观察TAT肽处理后的孢子囊和菌丝形态，确认是否破坏细胞壁结构。
- **复合物相互作用与功能验证**：
- **电泳迁移率转变分析（EMSA）**：评估TAT肽与dsRNA的电荷相互作用及复合物形成能力。
- **基因沉默效率测试**：通过定量PCR（qPCR）比较TAT/dsRNA复合物与裸露dsRNA对Pigpb1基因的抑制效果。
- **植物内转运实验**：
- **叶片渗透性测试**：将荧光标记的TAT肽喷洒在番茄和马铃薯叶片上，观察2小时和24小时后的荧光分布。
- **植物体内运输验证**：将番茄和拟南芥幼苗根系浸入TAT肽溶液，检测24小时后子叶叶片的荧光强度，评估木质部运输能力。

### 关键发现
1. **TAT肽的穿透效率最优**
- 在孢子囊和菌丝中，TAT肽的摄取效率显著高于其他三种CPPs（Arg9、MAP、Tp10）。其荧光信号在处理后5分钟即可在空孢子囊中检测到，且在24小时内仍保持较高积累水平。
- **电荷特性主导穿透效率**：TAT肽和Arg9均为强阳离子型肽（正电荷密度高），而MAP和Tp10为两性或疏水性肽，这可能与晚疫病菌细胞壁的负电荷成分（如β-葡聚糖）的静电吸附有关。

2. **能量与内吞途径无关的摄取机制**
- **代谢抑制剂实验**：在添加糖酵解抑制剂（2-脱氧-D-葡萄糖）和磷酸盐解抑制剂（亚硝酸钠）后，TAT肽的摄取效率未显著降低（p>0.05），表明其摄取不依赖细胞代谢活性。
- **内吞途径抑制无效**：使用氯丙嗪阻断吞噬体形成后，TAT肽的荧光强度与空白对照组无显著差异（p=0.06），提示其可能通过非内吞途径（如跨膜孔道或静电穿透）进入细胞。

3. **TAT/dsRNA复合物的形成与靶向作用**
- **复合物特性**：EMSA显示TAT肽与dsRNA通过静电作用形成复合物，复合物粒径约1.4微米（0.6-2.5微米）。扫描电镜证实处理后的孢子囊和菌丝细胞壁结构完整，无破损或异常增生。
- **协同沉默效应**：TAT/dsRNA复合物处理的晚疫病菌中，Pigpb1基因表达量较裸露dsRNA组降低约40%，而对照（TAT/gfp-dsRNA）组未观察到显著变化，表明复合物成功递送功能dsRNA并激活RNAi通路。
- **复合物摄取局限性**：尽管TAT/dsRNA复合物在细胞壁表面富集，但内部化效率较低。荧光共定位分析显示，Cy3标记的dsRNA与FAM标记的TAT肽在菌丝内呈现正相关（皮尔逊相关系数r=0.64），但裸露dsRNA几乎无法进入细胞。

4. **植物内转运潜力**
- **叶片表皮渗透**：TAT肽在番茄叶片上需24小时才能观察到细胞内荧光信号，而马铃薯叶片因表面蜡质层较薄，2小时后即可检测到荧光渗入表皮细胞。
- **系统性运输验证**：将TAT肽溶液浸泡拟南芥和番茄幼苗根系后，24小时内子叶叶片均检测到荧光，且番茄组荧光强度是对照组的1倍，拟南芥组为0.75倍，证实TAT肽可通过木质部实现长距离运输。

### 理论创新与实用价值
1. **首次证实CPPs在真菌中的功能化应用**
- 研究表明，TAT肽通过静电吸附与dsRNA结合，形成稳定复合物，并利用自身穿透能力突破晚疫病菌低效摄取dsRNA的瓶颈。这一机制可能适用于其他低摄取能力病原体（如白粉菌Colletotrichum gloeosporioides）。

2. **突破RNAi递送的技术瓶颈**
- 现有RNAi递送系统（如SIGS）依赖病原体自身RNAi machinery，但晚疫病菌天然缺乏高效摄取dsRNA的能力。TAT肽的引入显著提升了功能dsRNA的递送效率，为开发新型农业生物防治制剂奠定基础。

3. **植物内系统性递送的新策略**
- TAT肽在马铃薯叶片上的高效转运（尤其是茎毛）提示其可能通过特化细胞结构（如茎毛）进入植物组织，未来可结合纳米载体或脂质体技术增强靶向性。

### 局限性与未来方向
1. **复合物稳定性与靶向性优化**
- 当前实验中，TAT/dsRNA复合物主要在细胞壁表面富集，内部化效率较低。需通过化学修饰（如共价偶联）或结构设计（如pH响应型载体）改善复合物稳定性与释放可控性。

2. **跨物种应用潜力评估**
- 虽然TAT肽在番茄和拟南芥中均表现出系统性运输能力，但不同植物物种的蜡质层厚度、表皮细胞结构差异可能影响实际应用效果，需进一步验证。

3. **规模化田间试验需求**
- 当前研究基于实验室培养的晚疫病菌和离体植物组织，未来需开展温室或田间试验，评估TAT/dsRNA复合物在真实环境中的抗病效果及环境影响。

### 结论
本研究首次系统展示了TAT肽作为CPPs在提升晚疫病菌dsRNA摄取效率及RNAi沉默效率中的应用潜力。通过优化载体与递送系统，该技术有望突破传统RNAi递送限制，为开发基于RNA干扰的植物病害生物防治新产品提供重要参考。后续研究可聚焦于复合物结构优化、跨物种适用性验证及田间环境适应性测试。