在体外培养Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici过程中鉴定出的温度响应性miRNAs与植物体内的毒力变化相关

《Physics of Life Reviews》：Temperature-responsive miRNAs identified during i n vitro growth of Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici correlate with altered virulence potential i n planta

番茄枯萎病菌温度响应miRNA的调控机制研究。通过小RNA测序和RLM-RACE验证，发现28℃培养显著促进菌丝生长和孢子分化，并鉴定出Fol-miR-S13等温度调控miRNA，其靶向切割致病相关基因（如KNA98265），揭示温度通过miRNA介导的基因沉默影响病原菌生理及致病性。

　　

作者：Varsha A. Mahadik、S.M. Shivaraj、Narendra Kadoo

印度马哈拉施特拉邦浦那市CSIR-国家化学实验室生物化学科学部门，邮编411008

引言

番茄（Solanum lycopersicum L.）是全球主要种植的蔬菜作物之一。然而，它容易受到由土壤传播的真菌病原体Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici（简称Fol）引起的枯萎病的影响。这种病原体属于更广泛的Fusarium oxysporum物种复合体，其中一些真菌具有致病性，而另一些则没有[1]。由于Fol感染导致的产量损失范围从10%到80%不等，具体取决于番茄品种的敏感性、作物的生长阶段以及环境条件[2]。温度是影响植物疾病进展的关键环境因素之一：适宜的温度会促进病原体的生长和孢子形成，而过低或过高的温度则会抑制病原体的生长和植物的感染[3]。 microRNA（miRNA）是一种长度为21–24个核苷酸的单链非编码RNA分子，在基因调控中起着关键作用。它们通过与目标信使RNA（mRNA）结合来调节基因表达，从而导致mRNA的降解或翻译抑制。尽管大多数先前的研究都探讨了真菌的毒力基因和植物-病原体相互作用，但miRNA在真菌中的调控机制，尤其是在应对温度等环境压力因素时的作用，仍知之甚少。温度是植物-病原体相互作用中的关键因素，它可以增强或抑制真菌的生长、感染和繁殖[3]。鉴于温度在调节真菌生理和疾病进展中的重要作用，我们设计了这项研究，以探索尚未充分研究的受温度调控的真菌miRNA领域，因为温度可能影响Fol中miRNA的生物合成、表达和靶标定位，从而调节其致病潜力。这篇关于受温度调控的Fol miRNA的首次报告确立了它们在温度依赖性毒力调节中的作用。 miRNA介导的跨界基因调控在控制植物疾病方面具有广泛的意义，多项研究表明病原体miRNA可以调控其宿主植物中的基因[[4]、[5]、[6]]。通过对受Fol感染的Moneymaker和Motelle番茄品种进行小RNA测序，我们发现了一种跨界的miRNA——Fol-milR1，它能够靶向宿主基因，从而提供对病原体感染的抗性[5]。识别miRNA是理解它们在真菌生理和致病性中作用的前提。基于这些发现，本研究旨在实现以下目标：(i) 探索Fol miRNA的组成及其在两种生态相关温度（20°C vs. 28°C）下的差异表达；(ii) 通过小RNA测序鉴定新的和已知的Fol miRNA；(iii) 研究miRNA在真菌生长和毒力中的调控作用；(iv) 通过5’ RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增（RLM-RACE）实验验证它们的基因沉默机制。我们的研究表明，温度不仅影响Fol的生长和毒力，还通过miRNA介导的调控调节其基因表达。这些发现为了解这种植物病原真菌中的温度响应性小RNA调控机制提供了新的见解，有助于开发对温度敏感的疾病控制策略。

研究片段

真菌培养和番茄接种

Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici（MTCC 10270）菌株（NCBI登录号：BioSample SAMN14928763，样本名称NRRL_36464，SRA SRS6662244）从印度昌迪加尔CSIR-IMTECH的微生物类型培养物收集与基因库（MTCC）获得。冻干后的菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，HiMedia，Thane，印度）上复培养，并使用对Fol敏感的番茄品种Pusa Ruby进行感染性测试。Pusa Ruby的种子使用0.1%的消毒剂进行表面灭菌。

培养温度对Fol生长、孢子形成和致病性的影响

Fol菌株在PDA平板上分别在20°C和28°C的培养箱中培养10天。观察到Fol菌株的菌落直径和生长情况存在显著差异：20°C下的菌落生长速度较慢，但在培养7天后，20°C下的孢子数量高于28°C（见图1）。随后使用这些菌株进行了植物接种实验。

讨论

在本研究中，我们研究了温度对Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici的生长、感染性和miRNA谱的影响。观察到在20°C和28°C两种不同温度下，菌丝生长和孢子形成存在显著差异，其中28°C下的生长更为旺盛。强化的菌丝结构有助于保护孢子，从而增强真菌的致病性。

结论

本研究首次揭示了Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici中的温度响应性miRNA，强调了它们在真菌生长和毒力调节中的作用。在20°C和28°C下表达的miRNA集合不同，其中Fol-miR-S13被证实能够切割与毒力相关的转录本（KNA98265和KNB04665），这表明环境温度与miRNA介导的调控之间存在明确联系。这些结果表明，温度不仅影响...

作者贡献声明

Varsha A. Mahadik： 负责撰写初稿、数据验证、软件使用、资源准备、方法设计、实验实施及数据分析。 S.M. Shivaraj： 负责撰写初稿、数据验证、实验监督、软件使用、方法设计、实验实施及数据分析。 Narendra Kadoo： 负责审稿与编辑、实验监督、资源协调、项目管理和资金申请、概念构思。

资助

本研究得到了印度新德里科学工业研究委员会（CSIR）的支持（项目代码：MLP101226）。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢印度昌迪加尔CSIR-微生物技术研究所的微生物类型培养物收集与基因库（MTCC）提供的Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici（MTCC 10270）菌株。VM感谢印度新德里的大学资助委员会（UGC）提供的初级和高级研究奖学金，以及印度北方邦加齐亚巴德的学术科学与创新研究学院（AcSIR）提供的博士学位项目支持。SM感谢CSIR提供的研究资助。