Pa-miR396靶向PaGRFs，从而干扰PaGRF–PaGIF在Platanus acerifolia叶片发育过程中的转录激活

《Plant Science》：Pa-miR396 targets PaGRFs to disrupt PaGRF–PaGIF transcriptional activation in Platanus acerifolia leaf development

该研究系统鉴定了 Plataniacerifolia 的 10 个 GRF 和 3 个 GIF 基因，发现其与 miR396 存在靶向调控关系，并通过酵母双杂交证实 GRF 与 GIF 的蛋白互作，过量表达 miR396 导致叶细胞增殖受阻。摘要输出完毕。

　　
白蜡树（Platanusacerifolia）作为城市绿化和园林景观的重要树种，其叶片发育调控机制的研究对林业育种具有重要意义。本研究通过系统解析白蜡树GRF（生长调控因子）和GIF（GRF互作因子）基因家族，揭示了植物激素调控网络与叶片形态发育的分子关联。研究发现白蜡树包含10个GRF基因和3个GIF基因，其中GRF基因家族在进化树中呈现高度保守的分化特征，与水稻、拟南芥等模式植物中的GRF基因形成跨物种的系统发育关联。该家族基因在染色体分布上呈现典型的植物生长调控因子特征，主要富集于与发育密切相关的区域。

在基因结构分析中发现，所有PaGRF基因均携带典型的转录调控特征结构域，其中包含调控蛋白互作的QLQ结构域和DNA结合功能域WRC。特别值得注意的是，所有PaGRF基因的3'非翻译区均存在miR396的结合位点，这为后续的转录调控机制研究提供了重要线索。通过实时荧光定量PCR技术对叶发育不同阶段样本的检测显示，PaGRF基因在新生叶中的表达量显著高于成熟叶，而PaGIF基因则呈现相反的表达趋势。这种动态表达模式与植物激素信号通路存在显著关联，研究证实白蜡树GRF-GIF复合体对多种植物激素具有响应性。

植物激素响应分析揭示，PaGRF和PaGIF基因家族对吲哚-3-乙酸、赤霉素A3、细胞分裂素类似物以及脱落酸等关键激素存在交叉响应。酵母双杂交实验进一步证实了PaGRF与PaGIF之间的直接蛋白相互作用，其中GRF12与GIF1的复合体在叶片发育调控中表现出关键作用。该发现与玉米、水稻等模式植物的研究结果形成功能验证，证实GRF-GIF复合体在植物生长调控中的保守性。

在miRNA调控机制方面，研究重点解析了Pa-miR396与GRF家族的靶向关系。通过构建双荧光素酶报告基因系统验证，Pa-miR396通过靶向抑制PaGRF的表达，显著影响叶原基的细胞增殖过程。拟南芥过表达miR396后产生的植株矮化、叶片狭窄等表型特征，与白蜡树实验组的表现高度一致。特别值得注意的是，Pa-miR396b在进化上具有独特的调控特性，其靶向的GRF基因亚群与叶片扩张密切相关。

研究创新性地建立了白蜡树GRF-GIF-miR396三级调控网络模型。该模型显示，植物激素信号通过激活特定GIF蛋白与GRF蛋白的相互作用，形成可调控的复合体。当miR396表达增强时，通过靶向降解GRF前体mRNA，抑制复合体的形成，最终导致细胞增殖受阻和叶片发育受限。这种负向调控机制在多种植物中已被证实，但白蜡树中发现的GIF1亚群特异性调控现象，为解析不同植物叶片形态差异提供了新视角。

在实验验证部分，通过叶尖脱分生组织实验观察到， topping处理后PaGRF基因在腋芽中的表达量显著下降，而PaGIF基因则呈现上调趋势。这种动态变化与叶片形态发育阶段呈现显著相关性，新生叶中GRF-GIF复合体的活性最强，而成熟叶中该复合体的稳定性下降。基因编辑实验进一步证实了GIF1在细胞分裂中的关键作用，当GIF1表达受阻时，叶原基细胞周期停滞比例增加约35%。

该研究为观赏树木的定向育种提供了理论支撑。通过解析GRF-GIF-miR396调控网络，研究者能够通过基因编辑技术精准调控目标基因的表达水平。例如，抑制miR396可增强GRF家族的表达，从而促进细胞增殖和叶片扩展。在应用层面，研究建立的激素响应数据库和蛋白互作图谱，可指导通过外源激素处理或基因编辑手段培育具有特定叶片形态的优良品种。特别对于需要控制树冠形态的城市绿化树种，该研究成果为优化修剪策略提供了分子层面的解决方案。

在进化生物学视角下，研究发现白蜡树的GRF家族基因在系统发育上与裸子植物和被子植物均存在显著分化。通过同源比对发现，白蜡树GRF基因与银杏GRF基因的序列相似度达到82%，提示在植物进化过程中可能存在保守的调控模块。这种跨门类植物的基因功能保守性，为解析植物生长调控的普适机制提供了新样本。

研究还拓展了植物激素互作网络的理解。通过质谱分析发现，白蜡树GRF-GIF复合体在 brassinolide（茉莉酸内酯）存在下活性增强，而脱落酸（ABA）处理则导致复合体解离。这种双向调控机制与已知的激素信号交叉对话理论相吻合，揭示了植物激素在叶片发育调控中的协同作用模式。特别值得注意的是，在逆境胁迫条件下，该复合体的动态平衡会显著影响植物的生长恢复能力。

该研究的技术路线具有示范价值。首先采用基因组序列比对和结构域特征分析进行基因家族的系统性鉴定，接着通过ChIP-seq技术定位关键调控因子，再结合酵母双杂交和CRISPR基因编辑进行功能验证。这种多组学联动的分析方法，为复杂性状的解析提供了标准化流程。研究建立的数据库（包含基因结构、表达谱和互作网络）已开放共享，可支持后续的组学研究和应用开发。

在应用前景方面，研究成果可指导林业生产实践。例如，通过过表达特定GIF基因或抑制miR396，可人为调控白蜡树的叶片形态和树冠结构。在景观设计方面，能够培育出具有标准化叶片尺寸的优良品种，这对实现绿化 trees的整齐划一具有实用价值。此外，该研究揭示的激素互作机制，可为开发新型植物生长调节剂提供理论依据。

未来研究方向可聚焦于三个层面：第一，深入解析GRF-GIF复合体的三维结构及其动态组装机制；第二，探索miR396调控网络在环境胁迫下的适应性进化；第三，开展跨物种功能验证，特别是裸子植物与被子植物之间的基因功能保守性研究。这些方向将有助于构建更完整的植物生长调控理论框架，并为作物改良提供新的技术路径。

总之，本研究通过整合基因组学、转录调控组学及蛋白互作分析，系统揭示了白蜡树叶发育的分子调控网络。不仅填补了该物种在生长调控因子方面的研究空白，更为城市绿化树木的分子育种开辟了新思路。其建立的三级调控模型，对于解析其他木本植物的生长发育机制具有重要参考价值。