外源CaCl2通过蛋白质S-亚硝基化作用，在镉胁迫下增强了黄瓜（Cucumis sativus L.）不定根的形成

《Plant Science》：Exogenous CaCl 2 enhanced adventitious root formation in Cucumis sativus L. under Cadmium stress through protein S-Nitrosylation

钙离子通过NO依赖的S-亚硝基化调控镉胁迫下黄瓜侧根形成。研究显示，200 μM CaCl?显著促进Cd胁迫下黄瓜 explants的侧根发育，而Ca2?螯合剂和去硝基化试剂可逆转该效应。质谱鉴定发现117个S-亚硝基化蛋白，主要富集于氧化还原、糖酵解等通路，证实Ca2?-NO-S-亚硝基化信号轴在逆境根再生中起关键作用。

　　

牛丽娟|赵彦硕|王倩|蒲珊梅|余健

中国四川省绵阳市西南科技大学生命科学与农林学院，621010

摘要

镉（Cd）胁迫会严重阻碍植物的生长发育。钙离子（Ca²⁺）和一氧化氮（NO）参与植物的生长过程和应激反应。然而，它们在镉胁迫下促进不定根形成的相互作用机制尚不清楚。本研究发现，Ca²⁺对黄瓜不定根生长的促进作用具有剂量依赖性，在200 μM CaCl₂浓度时达到最大生物效应。此外，Ca²⁺螯合剂明显逆转了Ca²⁺在镉胁迫下促进不定根形成的积极作用，这表明Ca²⁺对镉胁迫下的不定根形成是不可或缺的。同时，去除内源性NO显著抑制了Ca²⁺诱导的根系生长。另外，外源性Ca²⁺显著增加了镉胁迫下的内源性NO生成和总S-亚硝基硫醇（SNO）水平，这表明S-亚硝基化可能参与了镉胁迫下Ca²⁺诱导的不定根形成。为了进一步探究S-亚硝基化是否是镉胁迫下Ca²⁺诱导不定根形成的关键分子开关，我们鉴定了潜在的S-亚硝基化蛋白。在CaCl₂处理下，总S-亚硝基化蛋白水平升高。然而，Ca²⁺螯合剂显著降低了镉胁迫下Ca²⁺诱导的蛋白S-亚硝基化程度。共鉴定出117种S-亚硝基化蛋白，这些蛋白主要参与氧化还原过程、代谢过程、糖酵解过程等生物学过程。此外，去亚硝基化剂处理显著降低了胁迫条件下不定根形成过程中的关键酶活性。这些结果表明，Ca²⁺诱导的关键蛋白S-亚硝基化可能通过差异性的S-亚硝基化参与镉胁迫下的不定根形成途径。总之，Ca²⁺可能通过NO依赖性的S-亚硝基化促进镉胁迫下的不定根形成。

引言

钙离子（Ca²⁺作为一种普遍存在的信号分子，对植物的生长发育至关重要（Hepler, 2005）。先前的研究表明，Ca²⁺参与多种生理过程（Chen et al., 2019）。此外，Ca²⁺可通过增强抗氧化系统和调节植物的生理生化过程来提高植物的抗逆性（Kanu et al., 2019）。越来越多的证据表明，Ca²⁺与一氧化氮（NO）在植物体内存在相互作用。一氧化氮作为一种重要的信号分子，已被证明参与多种生物过程（Sun et al., 2018）。有研究表明，NO在无胁迫和胁迫条件下几乎都能介导所有类型的Ca²⁺通道（Clementi and Meldolesi, 1997, Niu et al., 2017）。同时，细胞质中Ca²⁺浓度的升高可能触发并影响内源性NO的积累（Courtois et al., 2008）。钙通道抑制剂可能抑制NO的生成，说明NO的生成依赖于Ca²⁺（González et al., 2012）。因此，Ca²⁺与NO在植物体内的信号传导之间存在复杂的关系。

蛋白质的S-亚硝基化被认为是NO生物活性传递的关键机制，即NO分子与蛋白质半胱氨酸巯基共价结合形成S-亚硝基硫醇（SNO）（Lindermayr and Durner, 2009, Chen et al., 2020）。S-亚硝基化在植物的生长发育和应激反应中起着重要的调节作用（Yun et al., 2011, Lin et al., 2012, Yang et al., 2015）。有趣的是，动物研究的结果表明，Ca²⁺可能调节内皮细胞中组织转谷氨酰胺酶（tTG）的S-亚硝基化，从而导致TG酶活性抑制（Lai et al., 2001）。Chvanov等人（2006）还提出，钙可以调节胰腺腺泡细胞中的蛋白质去亚硝基化。这些证据为探索NO和钙信号传导之间的反馈调节提供了新的可能性。

镉胁迫通过缩短根系伸长区和分生区的长度以及破坏根细胞结构来抑制植物根系的生长和伸长（Yuan and Huang, 2016）。先前的研究表明，NO可以促进镉胁迫下黄瓜的不定根形成（Niu et al., 2023）。然而，尚不清楚是否涉及NO依赖的翻译后修饰在Ca²⁺调控的镉胁迫下不定根形成过程中起作用。基于上述发现，本研究的目的是阐明NO信号传导在镉胁迫下Ca²⁺促进黄瓜不定根形成过程中的作用。

实验材料与生长条件

黄瓜（Cucumis sativus）种子用5%次氯酸钠表面消毒10分钟，然后在温度为25°C、相对湿度为50–60%的气候培养箱中用蒸馏水发芽，光照/黑暗周期为14小时/10小时（光合有效辐射=200 μmols^-1m^-2），持续5天。当两片子叶完全展开（发芽5天后），去除这些幼苗的初生根（补充图S1），并将这些外植体用于后续实验

CaCl₂对镉胁迫下黄瓜不定根形成的影响

研究了不同浓度的CaCl₂对镉胁迫下不定根形成的影响（图1A-D）。如图1A-D所示，与对照组相比，CdCl₂处理显著降低了黄瓜外植体的根数、根长和鲜重。然而，较低浓度的外源性CaCl₂（50、100和200 μM）显著促进了黄瓜外植体的不定根形成。如图1A所示

讨论

多项研究表明，镉胁迫会抑制植物的根系生长和发育（Yuan and Huang, 2016）。根据我们的结果，CdCl₂抑制了黄瓜外植体的不定根形成过程，但适宜浓度的CaCl_{2+显著促进了镉胁迫下的不定根形成，这表明Ca²⁺对促进黄瓜不定根形成是必不可少的（图1A-D）。先前的研究表明，Ca²⁺可能参与}

结论

总体而言，本研究表明，不同浓度的CaCl₂处理对镉胁迫下黄瓜不定根的形成有显著影响。然而，Ca²⁺螯合剂显著逆转了Ca²⁺的积极作用，表明Ca²⁺在诱导镉胁迫下的不定根形成中可能起关键作用。此外，我们的结果还发现NO参与了镉胁迫下Ca²⁺诱导的不定根形成。另外，外源性的Ca²⁺

未引用的参考文献

(Abd-Allah et al., (2017)

资助

本研究得到了四川省科学技术厅自然科学基金（2023NSFSC1244）、西南科技大学博士科研基金项目（20zx7135）和西南科技大学博士科研基金项目（20zx7132）的资助。

CRediT作者贡献声明

牛丽娟：撰写——审稿与编辑、监督、资源提供、实验设计、数据分析、概念构建。 赵彦硕：撰写——初稿撰写、数据可视化、验证、软件使用、数据管理。 王倩：监督、软件使用、实验设计。 蒲珊梅：数据可视化、软件操作。 余健：监督、资源提供、资金争取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。