基于碳点的聚合物复合物，结合细胞穿透肽用于基因转染

《RSC Advances》：Carbon dot-based polyplexes with cell penetration peptides for gene transfection

基因递送系统中碳纳米点与细胞穿透肽的协同增效及机制研究。通过溶胀热法合成碳点（CDs）和Hummers法制备石墨烯量子点（GO QDs），分别与PF14、PF221肽形成聚离子复合物，评估其对pGL3质粒和剪接校正寡核苷酸（SCO）的递送效率。实验表明PF14-CD复合物在质粒和SCO递送中均表现最优，其高效性源于碳点的纳米尺寸和丰富的表面官能团增强的细胞摄取，尤其是通过SCARA受体介导的内吞作用实现。XRD、TEM和zeta电位分析证实复合物形成及理化特性符合设计要求。该研究为开发高效非病毒基因载体提供了新策略。

　　
该研究系统评估了碳纳米材料与细胞穿透肽（CPP）协同作用在基因递送中的效能。研究团队以石墨烯氧化物量子点（GO QDs）和碳点（CDs）为载体，结合PF14和PF221两种 CPP，通过物理化学特性表征与细胞实验验证，揭示了多聚体复合物（polyplexes）的递送机制与优化策略。

在材料制备方面，GO QDs采用改进的 Hummers 法制备后经酸解处理形成纳米级颗粒，CDs则通过 eco-friendly 溶热法以维生素C为前驱体合成。结构表征显示，GO QDs具有典型的层状氧化石墨烯特征（XRD 峰值位于10.2°和25°），而 CDs 表现出非晶态碳材料的宽泛衍射图谱（主峰20.1°）。透射电镜证实CDs为1-2 nm的均一球形颗粒，与GO QDs的层状结构形成对比。表面电荷分析表明，GO QDs（-15.4 mV）和 CDs（-12.7 mV）均具有负电性，但通过接枝阳离子肽链可显著调节复合物表面电荷，这对细胞膜相互作用至关重要。

基因递送效能的对比实验显示，PF14-C CDs polyplexes 在pGL3和SCO递送中均表现出最优性能。对于pGL3递送，PF14-C复合物的转染效率达220%，显著优于PF221-GO QDs系统（82%）和裸PF14（95%）。在SCO递送中，该系统的效率提升更为显著，较PF221-GO QDs提高2.5倍。值得注意的是，虽然引入壳聚糖（CTS）可改善某些纳米颗粒的稳定性，但修饰后的复合物（如PF14-C-CTS）转染效率反而下降30%-40%，表明电荷中和可能干扰递送过程。

机制研究部分发现，PF14-C复合物通过SCARA受体介导的内吞作用实现高效递送。实验采用特异性抑制剂（dextran sulfate、polyinosinic acid、fucoidan）验证该通路，结果显示抑制剂使转染效率降低90%以上，而对照抑制剂（chondroitin sulfate、polycytidylic acid、galactose）未产生显著影响。这种特异性抑制证实了SCARA受体在细胞摄取中的关键作用，同时排除了其他常见内吞途径（如 caveolae 依赖性或 macropinocytosis）的主导地位。

研究进一步揭示了材料特性与递送效能的关联：CDs的纳米级尺寸（1-2 nm）和表面高密度官能团（羟基、羧基）使其与PF14形成稳定复合物。实验数据显示，CDs比GO QDs（3-5 nm）多出2倍的有效递送量，这与其更大的比表面积（35.6 m2/g vs. 12.4 m2/g）和更好的生物相容性密切相关。特别值得注意的是，PF14的疏水结构使其能有效包裹带负电的DNA/RNA，形成电荷平衡的多聚体，这种特性在改善体内外稳定性方面优于传统阴离子载体。

临床转化潜力方面，研究团队构建的PF14-C系统展现出显著优势：1）转染效率较商业化Lipofectamine? 2000提升2.8倍；2）在HeLa细胞和脑胶质瘤U87 MG-Luc2细胞中均保持高效递送；3）未观察到显著细胞毒性（存活率>90%）。这些特性使其在脊髓性肌萎缩症（SMA）等遗传病治疗中具有潜在应用价值，特别是对需要深入中枢神经系统的递送场景。

优化策略研究指出，复合物结构设计存在关键平衡点：GO QDs的层状结构虽能增强机械稳定性，但其刚性表面导致细胞膜穿透效率降低；而CDs的柔性非晶态结构更易与肽链结合形成多聚体。实验通过引入聚谷氨酸（未详述具体方法）证实，适度增加复合物电荷密度（-5 mV至-8 mV）可使跨膜效率提升15%，但超过-10 mV时出现电荷排斥效应，递送效率反而下降。这种电荷密度的双刃剑效应为载体优化提供了重要启示。

在递送机制层面，研究揭示了多级递送策略：初始通过阳离子肽链（PF14）介导的跨膜穿透，纳米颗粒载体（CDs）通过SCARA受体介导的内吞作用进入细胞，随后通过溶酶体逃逸机制（如pH响应性聚集体解离）实现核内递送。这种协同机制在对比实验中得到充分验证：当SCARA抑制剂存在时，PF14-C复合物的递送效率下降至对照组的17%；而用中性载体（如脂质体）替代CDs时，转染效率降低40%-50%。

研究还发现，复合物稳定性与递送效率存在非线性关系：GO QDs复合物因层状结构具有更高机械强度（Zeta电位-15.4 mV），但其转染效率仅为CDs复合物的1/3。这表明载体不仅需要具备适当的物理稳定性，更要与细胞膜表面电荷形成最佳匹配。实验数据显示，当复合物表面电荷从-12.7 mV（裸CDs）调整至-5.2 mV（接枝2:1的PEI）时，转染效率提升至280%，但细胞毒性也相应增加12%。这提示需要通过表面功能化（如修饰肝素样分子）在稳定性和生物安全性之间取得平衡。

在应用场景扩展方面，研究团队成功将系统拓展至siRNA递送：使用1:1（peptide:siRNA）比例时，PF14-C复合物对siRNA的递送效率达180%，且未出现明显的基因沉默副作用。这种多功能性使其在肿瘤治疗（siRNA沉默）、免疫调节（SCO递送）和基因修复（pGL3递送）等多领域具有转化潜力。

该研究的重要突破在于建立了"三螺旋递送系统"理论：通过"肽链（PF14）-纳米载体（CDs）-基因荷载（pGL3/SCO）"的三重协同作用，实现递送效率的指数级提升。具体表现为：1）PF14的疏水-亲水平衡结构增强复合物稳定性；2）CDs的表面官能团形成电荷缓冲层，减少基因损伤；3）纳米颗粒的刚性骨架辅助溶酶体逃逸。这种系统化优化思路为非病毒基因载体开发提供了新范式。

后续研究建议可聚焦以下方向：1）开发pH/酶响应型多聚体以实现精准递送；2）构建SCARA受体靶向修饰模块（如Fucoidan锚定）；3）探索在体模型验证递送效率。此外，建议开展长期毒性评估，特别是CDs的潜在氧化应激效应，以及复合物在复杂生物环境中的稳定性测试。

该成果标志着碳基纳米载体在基因治疗领域的重大进展，其核心价值在于揭示了：1）非晶态碳点（CDs）较晶态量子点（GO QDs）具有更优的递送效能；2）特定CPP（PF14）与纳米载体的协同作用可突破常规递送瓶颈；3）SCARA受体介导的内吞是此类复合物的关键摄取途径。这些发现为新型基因治疗载体的设计提供了理论依据和实验范式。