三齿蛇葡萄（Rhoicissus tridentata）的植物化学成分、抗菌活性及急性毒性研究——用于处理犬咬伤

狗咬伤相关细菌感染的传统草药Rhoicissus tridentata根部提取物经代谢组学分析鉴定出15种活性多酚类化合物，包括黄酮、单宁等，并验证其具有中等抗菌活性（MIC 0.78-6.25 mg/mL，MBC/MIC比1.9-2），且急性毒性实验显示LD50>5000 mg/kg，安全性良好。该研究首次通过高分辨质谱技术系统解析了该植物的抗感染机制及安全性。

　　
乌干达传统草药Rhoicissus tridentata根提取物抗菌活性及安全性研究

摘要部分揭示了狗咬伤引发的复合微生物感染已成为全球公共卫生问题，尤其在非洲地区。传统医学中，R. tridentata的根部被用于狗咬伤治疗，但该植物次生代谢产物谱系、抗菌机制及安全性缺乏科学验证。本研究通过高分辨质谱联用技术（UHPLC-HRMS/MS）结合分子网络分析（GNPS2），首次系统鉴定出15种活性多酚类化合物，包括黄酮醇、单宁及花青素衍生物。体外实验显示，该提取物对6种常见犬口源性致病菌（包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等）均具有抗菌活性，MIC范围0.78-6.25 mg/mL，MBC/MIC比值1.9-2.0，表明其作用机制为典型的杀菌模式。体内急性毒性实验证实提取物经口给药至5000 mg/kg剂量仍属安全，LD50超过5000 mg/kg，且未观察到肝肾毒性或血液学异常，为传统草药的安全应用提供了科学依据。

研究采用创新性的代谢组学技术，通过UHPLC-HRMS/MS系统结合MZmine数据处理平台，首次实现了对R. tridentata根提取物的全面化学指纹图谱构建。实验鉴定出具有显著抗菌活性的黄酮类化合物群，包括已知活性成分的Fisetin（芦丁）、Kaempferol（槲皮素）、Quercetin（槲皮素）、Ellagic acid（芦丁酸）等，以及首次从Rhoicissus属中分离出的Isokaempferide（异山柰酚）、3-O-methylquercetin（3-O-甲基槲皮素）等新型衍生物。分子网络分析显示，这些活性成分形成了具有显著抗菌协同效应的次生代谢网络体系。

抗菌活性评估采用改良版琼脂扩散法与稀释法结合，创新性地引入MBC/MIC比值判断标准。结果显示，对革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌、链球菌属）的抑制效果优于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌）。其中金黄色葡萄球菌对提取物的敏感性最高，抑菌圈达22 mm，MIC为3.13 mg/mL，MBC/MIC比值1.99，表明该菌对活性成分敏感且作用高效。而大肠杆菌虽敏感性较低（MIC 6.25 mg/mL），但MBC/MIC比值同样达到2.0，显示杀菌特性。

安全性评估突破传统细胞毒性实验局限，通过瑞士 albino 小鼠模型进行14天动态观察。剂量梯度实验显示，5000 mg/kg剂量组未出现死亡或器官形态学改变，仅观察到剂量依赖性体重增长减缓（P<0.05），但系数变化在正常生理波动范围内。血液学检测表明，给药组红细胞计数（RBC）和血红蛋白浓度（HCT）升高15%-20%，可能源于植物活性成分的免疫调节作用，而白细胞（WBC）和血小板（PLT）指数下降提示非特异性免疫抑制效应。值得注意的是，该现象未伴随出血倾向或骨髓抑制，显示其作用机制具有双重调节特性。

研究首次将代谢组学与药效学结合，发现活性成分的构效关系：具有邻二酚羟基结构的化合物（如Fisetin）和甲氧基取代黄酮（如3-O-methylquercetin）对革兰氏阳性菌表现出更强亲和力。质谱分析显示，某些代谢物存在同位素峰群现象，经核磁共振（NMR）验证为天然产物中的甲氧基取代异构体，这可能是影响抗菌活性的关键结构特征。

传统草药学与现代技术结合为本研究提供重要启示。在结构鉴定方面，结合UPLC-MS/MS的准分子离子峰（[M+H]?）和碎片离子特征，首次解析了R. tridentata根中复杂的酚类衍生物体系。特别是发现该植物含有独特的前花青素二聚体（如fisetinidol-catechin复合物），这类分子可能通过螯合金属离子或破坏细菌细胞膜完整性发挥杀菌作用。

实验还发现，部分代谢物具有双重活性：如Kaempferol（槲皮素）既可抑制细菌生物膜形成，又能促进伤口愈合相关的细胞因子表达。这种多靶点作用机制解释了为何传统应用中单次给药即可获得持续疗效。研究团队通过比较不同浓度提取物的MIC值变化，发现当浓度超过MIC值2倍时，杀菌效率提升300%，这为开发缓释制剂提供了理论依据。

在安全性评价方面，突破传统急性毒性测试的局限，通过连续14天的行为观察和器官系数分析，发现提取物在剂量超过5000 mg/kg时才会引发轻度神经毒性（震颤、瘙痒），但未观察到肝肾功能指标异常。这一发现与前期体外细胞毒性实验结果形成对比，提示该植物可能通过调节肠道菌群或激活肝脏解毒酶系统来降低毒性。

未来研究方向建议从三方面深化：首先建立代谢物-抗菌活性数据库，通过机器学习预测新型衍生物；其次开展结构修饰实验，比较甲氧基取代基对活性的影响规律；最后应进行长期毒性实验，特别是对生殖系统、免疫系统的影响评估。此外，开发基于活性成分的纳米递送系统可能解决传统煎煮制剂生物利用度低的问题。

该研究为传统草药现代化提供了范本，其创新性体现在：1）首次系统解析R. tridentata的代谢组学特征；2）建立包含MIC、MBC和生物膜抑制率的综合评价体系；3）揭示甲氧基取代黄酮的杀菌新机制。这些发现不仅验证了传统用药的合理性，更为开发新型抗菌药物开辟了天然产物来源，对应对全球抗生素耐药性挑战具有重要实践价值。