《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Colorimetric “off–on” sensing of penicillamine via copper-mediated modulation of laccase-mimetic activity of trimanganese tetroxide nanoflowers
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本研究开发了一种基于Cu2+调控的Mn?O?纳米花“off-on”颜色传感平台，用于高效检测青霉胺（D-PA），其灵敏度为4.8 nM，在复杂基质中表现出优异选择性和临床实用性。传统检测方法存在成本高、操作繁琐等问题，而本方法通过纳米材料与金属离子的特异性相互作用实现快速定量分析，为药物监测提供新策略。
阿里·M·阿拉西姆（Ali M. Alaseem）、格洛维·阿拉西里（Glowi Alasiri）、拉马丹·阿里（Ramadan Ali）、钟皮尔·帕克（Jong Pil Park）、阿尔-蒙塔塞尔·贝拉·H·阿里（Al-Montaser Bellah H. Ali）、奥马尔·A·阿尔穆罕默德（Omar A. Almohammed）、优素福·A·本·贾尔丹（Yousef A. Bin Jardan）、穆罕默德·M·埃尔-韦基尔（Mohamed M. El-Wekil）
沙特阿拉伯利雅得伊玛目穆罕默德·本·沙特伊斯兰大学（Imam Mohammad Ibn Saud Islamic University, IMSIU）医学院药理学系
摘要
D-青霉胺（D-PA）被广泛用于治疗威尔森病（Wilson's disease）、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis）和胱氨酸尿症（cystinuria）；然而，其狭窄的治疗窗口以及严重的肾脏、血液系统和自身免疫并发症风险要求进行精确的治疗监测。传统方法如高效液相色谱法（HPLC）虽然能够提供准确的定量结果，但成本高昂、耗时且需要复杂的仪器设备，限制了其常规使用。基于纳米酶的比色法作为一种快速且经济高效的替代方法出现，但大多数报道的系统存在选择性有限和依赖不稳定氧化剂的问题。本文报道了一种新型的“开关式”比色传感器，该传感器利用了类似漆酶（laccase）的活性，这种活性由Mn?O?纳米颗粒在Cu2?离子的调控下实现。在该系统中，Cu2?离子抑制了2,4-DP的催化氧化反应，而D-PA的结合则有效螯合了Cu2?离子，从而恢复催化活性并产生可测量的颜色变化。该传感器达到了4.8 nM的超低检测限，在复杂样品中仍表现出优异的选择性，并在药物制剂、血清和尿液中实现了可靠的D-PA定量。这一策略结合了灵敏度、操作简便性和环保性，使其成为临床和药物监测中传统色谱分析方法的实用替代方案。
引言
D-青霉胺（D-PA）是一种含有巯基的非蛋白质氨基酸，也是青霉素的降解产物，因其强效的铜螯合能力而在临床治疗中得到广泛应用[1]。它仍是威尔森病（肝豆状核变性）的一线药物，也被用于重金属中毒的解毒[2]。除此之外，D-PA在类风湿性关节炎、胱氨酸尿症和系统性硬化症中也显示出治疗效果，体现了其广泛的药理意义[3]。然而，其临床应用受到严重不良反应的限制，尤其是肾病综合征、口腔溃疡、胃肠道不耐受和厌食症，这些因素大大限制了其长期使用[4]。鉴于其狭窄的治疗窗口、不可预测的患者反应以及高毒性风险，精确监测生物流体中的D-PA浓度对于有效治疗和患者安全至关重要。因此，迫切需要能够在复杂生理环境中运行的灵敏且具有选择性的检测平台，这不仅有助于确保适当的剂量，也有助于推进药代动力学研究和个性化医疗的发展。目前的D-PA分析方法包括高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳、伏安法、化学发光法和荧光法[5][6][7][8][9]。尽管这些方法具有高灵敏度和可靠性，但通常需要复杂的仪器设备、耗时的样品制备和受过培训的人员，这阻碍了它们在临床环境中的常规应用。相比之下，比色法由于其低成本、操作简便性和无需先进设备的直接可视化读数而特别具有吸引力[10]。
天然酶在温和的生理条件下表现出显著的催化活性和底物特异性，使其适用于比色传感。然而，由于生产成本高、储存和操作过程中的不稳定性以及在高压试验条件下的变性倾向，它们的临床和分析应用受到严重限制[11,12]。为了克服这些缺点，具有类似酶催化特性的纳米酶（nanozymes）作为有前景的替代品应运而生。与天然酶相比，纳米酶具有更低的成本、优异的稳定性、可调的催化活性和多样的结构设计，使其在生物传感和环境监测中具有吸引力[13]。常见的纳米酶类别包括贵金属纳米结构[14]、碳基纳米材料[15]、过渡金属氧化物[16]和金属有机框架（MOFs）[17]。
类似漆酶的纳米酶（laccase-like nanozymes）由于具有比天然漆酶更简单的配位结构，通过模仿漆酶的结构和途径，显示出相当甚至更强的催化活性[18,19]。设计高性能纳米酶通常涉及复制天然漆酶的催化中心，通常是通过铜与天然配体的直接配位实现的[20,21]。虽然这些方法可以在温和条件下生成稳定的纳米酶，但其催化位点容易聚集，限制了底物的接触并降低了结构精度[22,23]。为了解决这个问题，已经开发出了具有高活性和原子利用率的单原子纳米酶[24,25]。然而，它们的合成需要苛刻的条件，限制了实际应用[26,27]。因此，迫切需要能够在温和条件下制备出分散良好、结构精确的类似漆酶的纳米酶的方法。
锰（II/III）氧化物（Mn?O?）是一种典型的尖晶石型过渡金属氧化物，由于其多样的物理化学性质和在能量存储、催化、环境修复和吸附等领域的广泛应用而受到广泛关注[28]。除了这些领域，Mn?O?纳米结构最近被证明具有内在的氧化酶和类似漆酶的活性，成为强大的纳米酶。特别是八面体结构的Mn?O?表现出强烈的氧化酶样行为，可用于构建简单的单信号比色传感器，实现对多种分析物的敏感检测[29]。据我们所知，目前尚未有利用Mn?O?纳米颗粒类似漆酶活性的D-PA检测比色策略，因此本研究填补了这一重要空白。
本文报道了一种新型的D-PA比色传感平台，该平台使用锰（II/III）氧化物纳米花（Mn?O? NFs）作为类似漆酶的纳米酶，其催化活性由Cu2?离子调节。在该系统中，Cu2?离子的引入显著抑制了Mn?O? NFs的天然类似漆酶的活性。随后加入D-PA后，D-PA与Cu2?之间的强螯合作用有效螯合了金属离子，从而恢复了Mn?O? NFs的催化活性。这种“开关式”行为转化为浓度依赖的颜色响应，通过吸光度变化实现D-PA的定量检测。重要的是，这种Cu2?介导的策略消除了对生物识别元件的需求，提供了一种简单、选择性强且无需酶的传感方法，具有强大的临床监测和药物分析潜力。
材料与试剂
D-青霉胺（D-PA）、多巴胺（dopamine）、葡萄糖（glucose）、胆固醇（cholesterol）、尿酸（uric acid）、甘氨酸（glycine）、丙氨酸（alanine）、赖氨酸（lysine）、腺嘌呤（adenine）、色氨酸（tryptophan）、4-氨基安替比林（4-AAP）、2,4-二氯苯酚（2,4-DP）、儿茶酚（catechol）、苯酚（phenol）、3-氨基酚（3-aminophenol）、油酸（oleic acid）、高锰酸钾（potassium permanganate, KMnO?）、氯化铜（II）二水合物（CuCl?·2H?O）、磷酸二氢钠（sodium dihydrogen phosphate, NaH?PO?）、盐酸（hydrochloric acid, HCl）、磷酸二氢钠（sodium dihydrogen phosphate, Na?HPO?）、氢氧化钠（sodium hydroxide, NaOH）、乙腈（acetonitrile, ACN）和二甲基甲酰胺（dimethylformamide, DMF）均购自
检测原理
已知铜离子（Cu2?）能与含有巯基的配体（如D-PA）形成稳定的复合物[3,32]，这为选择性传感提供了理论基础。我们研究了Mn?O? NFs、Cu2?和D-PA之间的相互作用，观察到Cu2?显著抑制了Mn?O? NFs的类似漆酶的活性。加入D-PA后，催化活性以浓度依赖的方式得到恢复。这种可逆的“开关式”行为是设计灵敏且选择性强的比色传感的基础
结论
本研究表明，Cu2?是Mn?O? NFs类似漆酶活性的强效抑制剂，导致比色信号显著减弱。加入D-PA后，Cu2?优先与D-PA结合而非Mn?O?，从而恢复了催化活性并产生了与D-PA浓度成正比的吸光度响应。利用这一机制，开发了一种新型的“开关式”比色传感平台
资助
本研究得到了伊玛目穆罕默德·本·沙特伊斯兰大学（Imam Mohammad Ibn Saud Islamic University, IMSIU）科研处的支持和资助（资助编号：IMSIU-DDRSP2501）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
